羊毛角蛋白是一种异质性纤维蛋白，其高胱氨酸含量使其区别于其他结构蛋白。在羊毛纤维的皮质层中，α-角蛋白和β-角蛋白分别是由细丝基质构成的纳米结构。两者通过氢键、盐式键、二硫键相互纠缠，很难分离。同时，因为α-螺旋结构的热力学稳定性不如β-片状结构，α-角蛋白在溶解和提取过程中容易转化为β-角蛋白，很难获得高含量α-螺旋结构的再生角蛋白。角蛋白提取过程中的挑战阻碍了α-角蛋白的利用，通常α-角蛋白一般只应用于美容美发等利用率较低的领域。
在本文中，通过筛选两种金属盐与四种还原剂形成的84种混合溶剂，得出最优的8组实验体系。通过计算和分析得出最优的提取条件是：还原剂为1.5 M硫化钠、金属盐为0.3 M溴化锂、表面活性剂为0.02 M十二烷基硫酸钠。在该提取条件下，羊毛溶解率为77.33 %，羊毛角蛋白提取率为65.01 %，α-螺旋结构含量为27.58 %。与纯羊毛纤维中α-螺旋结构含量（28.23 %）相比，该提取工艺可以较大程度地保留α-螺旋结构（保留率为97.70 %）。进一步，通过XRD、FTIR和EDS分析，系统研究了不同溶解体系对α-螺旋结构的影响；基于再生角蛋白的结构和性质，提出了高含量α-角蛋白的提取机理，为α-螺旋角蛋白基材料的广泛应用奠定了研究基础。
1. 探索了不同种类还原剂/金属盐对羊毛溶解的影响。
2. 最优的溶解体系展示了高的羊毛溶解率（77.33 %），羊毛角蛋白提取率（65.01 %），羊毛角蛋白产率（50.27 %）。
3. 最优溶解体系所提取的羊毛角蛋白含有27.85 %的α-螺旋结构。与原羊毛纤维相比，α-螺旋结构保留率为97.70 %。
图1 羊毛角蛋白的结构与分子式：(a) α-螺旋角蛋白的组成与分布；(b) 羊毛角蛋白的二级结构；(c) 羊毛角蛋白的分子式。
羊毛纤维具有复杂的层次结构，含有无定形的角蛋白基质和纳米级有序的纤维晶体，如图 1a所示。角蛋白是羊毛纤维的主要成分，主要存在于羊毛纤维的原纤结构中。羊毛角蛋白结构单体由呈α-螺旋状多肽链排列形成。依靠α-螺旋的二硫键，两个单体相互平行、相对缠绕形成超螺旋二聚体。超螺旋二聚体以反平行排列和端对端形式构成四聚体，其中一个超螺旋二聚体的N端与另外一个超螺旋二聚体的C端形成氢键。随后，每个四聚体以头尾相连的方式延伸组装成原丝，进一步根据半分子长度交错的原理，两条原丝相互平行缠绕形成八聚体。通常，8个四聚体或4个八聚体形成中间丝。
从基本结构上看，羊毛角蛋白是蛋白质的一种，它本身含有蛋白质的四级结构——一级、二级、三级和四级结构。羊毛角蛋白的一级结构是由20种氨基酸组成。羊毛角蛋白的一级结构旋转排列会形成二级结构，主要为α-螺旋结构、β-片状结构（β-折叠链结构与β-转角结构）、无规则结构（图 1b）。二级结构无规则旋转排列形成三级结构，三级结构又称为亚基，主要靠疏水相互作用、静电作用、氢键等维系。四级结构是由三级结构旋转排列组成的，配位键是维系四级结构的主要作用力。羊毛角蛋白的三级结构与四级结构的存在会增加羊毛角蛋白中氢键、盐式键、二硫键的含量，形成如图 1c所示的羊毛角蛋白分子式，促使羊毛角蛋白结构更为紧密，力学性能变好，化学稳定性变强；同时降低了羊毛角蛋白的水溶性，增加了羊毛角蛋白提取再利用工作的难度。
图2 (a) 羊毛溶解与羊毛角蛋白提取的过程；(b) 在1.5 M还原剂、0.3 M金属盐、0.02 M表面活性剂溶解条件下的羊毛溶解率、羊毛角蛋白提取率、羊毛角蛋白产率。
羊毛角蛋白提取的具体过程如图2a所示，主要分为：预处理、溶解、过滤、纯化、烘干等步骤。通过对比84组溶解体系的羊毛溶解率、羊毛角蛋白提取率、羊毛角蛋白产率，得出最优的8个体系，如图2b所示。最优体系中所有还原剂浓度为1.5 M，金属盐浓度为0.3 M，表面活性剂浓度为0.02 M。在Na2S体系中，羊毛溶解率、羊毛角蛋白提取率、羊毛角蛋白产率最高，其中当金属盐为LiBr时羊毛溶解率、羊毛角蛋白提取率、羊毛角蛋白产率分别为77.33 %、65.01 %、50.27 %。当金属盐为LiBr时，溶解速率依次为NaHSO3、Cys、Na2S2O3。当ZnCl2作为金属盐时，也出现了类似的结果。结果表明，强还原性的还原剂有利于羊毛纤维的溶解和羊毛角蛋白的提取。
图3红外光谱图：(a) 羊毛纤维；(b) 用1.5 M Na2S、0.3 M LiBr/ZnCl2、0.02 M SDS溶解体系中提取羊毛角蛋白红外光谱图。放大的酰胺结构：(c) 酰胺A结构；(d) 酰胺I结构；(e) 酰胺II结构；(f) 酰胺III结构。
为了证明实验的成功，对最优体系的羊毛角蛋白进行红外光谱测试。在图 3a中，羊毛纤维的FTIR光谱显示了酰胺A结构、酰胺I结构、酰胺II结构和酰胺III结构的特征吸收带。3300 cm-1处的酰胺A结构特征峰主要由2855 cm-1 ~ 2925 cm-1内的N-H拉伸和C-H拉伸振动产生。羊毛纤维中酰胺I结构的吸收峰在1600 cm-1处，这是由C=O拉伸振动引起的。羊毛纤维酰胺II结构的吸收峰在1500 cm-1处，主要与C-H拉伸和N-H弯曲振动有关。羊毛纤维酰胺Ⅲ结构的吸收峰在1200 cm-1处，主要与C-N拉伸和C=O弯曲振动交替组合。图 3b为Na2S-Li体系和Na2S-Zn体系提取的羊毛角蛋白的的红外光谱图。从图中可以看出，提取的羊毛角蛋白光谱与羊毛纤维的光谱相似，酰胺A结构、酰胺I结构、酰胺II结构和酰胺III结构都存在，说明从不同的提取液中提取角羊毛蛋白，其化学结构没有明显的变化。进一步观察，与羊毛纤维的酰胺结构相比，提取羊毛角蛋白的酰胺I结构、酰胺II结构和酰胺III结构发生了轻微的移位。尤其以ZnCl2作为金属盐时，提取羊毛角蛋白酰胺结构的移位程度更为明显，说明提取的羊毛角蛋白二级结构与原羊毛纤维的相比具有一定的差异（图3c-3f）。
图4 XRD分析：(a) 羊毛纤维；(b) 1.5 M Na2S、0.3 M LiBr/ZnCl2、0.02 M SDS体系对应的羊毛角蛋白；(c) Na2S-Li拟合图；(d) Na2S-Zn拟合图；(e) 羊毛纤维拟合图。(f) 羊毛纤维的EDS。
通过XRD分析，可以了解羊毛纤维与羊毛角蛋白的结晶度结构。图 4a为羊毛纤维的XRD图，从图中可以明显的观察到α-螺旋结构与β-片状结构的特征峰，分别为：10°与20°。Na2S-Li中提取的角蛋白的XRD图与羊毛纤维的XRD图具有非常高的相似性，但是峰强明显变弱（图 4b）。为了了解二级结构的变化趋势，对提取角羊毛蛋白和羊毛纤维的XRD进行拟合，图4c-4e表明α-螺旋结构的含量发生了很大的变化。在Na2S-Li和Na2S-Zn中羊毛纤维和提取羊毛角蛋白有两个峰，在10°处为α-螺旋结构特征峰，在20°处为β-片状结构特征峰，与羊毛纤维的二级结构相比（α-螺旋结构含量为25.95 %，β-片状结构含量为74.05 %），Na2S-Zn和Na2S-Li提取的角蛋白α-螺旋结构较少。
图5 (a) 提取角蛋白中蛋白质和N元素的含量；(b)和(c) 与其他文献的羊毛溶解率与角蛋白提取率进行比较。
羊毛纤维的EDS图可提供元素氮的百分比含量为15 %，根据公式可得到羊毛纤维中含有95 %的蛋白质，如图 4f所示。同时，在不同的提取体系中，蛋白质和N元素的含量也发生了变化，如图 5a所示。结果表明，当还原剂类型相同，金属盐为LiBr时，羊毛角蛋白的N含量和蛋白质含量较高。当金属盐类型相同，还原剂为Na2S时，羊毛角蛋白的N含量和蛋白质含量最高。图 5b和图 5c对比了其他工作的羊毛溶解率与羊毛角蛋白提取率。
图6不同溶解体系羊毛角蛋白的FTIR拟合分析：(a) Na2S-Li；(b) Na2S2O3-Li；(c) NaHSO3-Li；(d) Cys-Li；(e) Na2S-Zn；(f) Na2S2O3-Zn；(g) NaHSO3-Zn；(h) Cys-Zn。
为了更准确地分析二级结构的变化，对FTIR光谱进行了相关拟合，如图 6所示。酰胺I结构在1600 cm-1 ~ 1700 cm-1范围内，具有更丰富的二级结构，通过高斯拟合可得羊毛角蛋白的二级结构分布。图 6为羊毛角蛋白的FTIR拟合光谱，其中“S”为β-折叠链结构，“A”为无规则结构，“H”为α-螺旋结构，“T”为β-转角结构。α-螺旋结构范围为1661 cm-1 ~ 1646 cm-1，β-折叠链结构范围为1637 cm-1 ~ 1615 cm-1和1698 cm-1 ~ 1682 cm-1，β-转角结构为1681 cm-1 ~ 1661 cm-1，无规则结构为1645 cm-1 ~ 1637 cm-1。根据峰面积的比值，羊毛纤维中α-螺旋结构占28.23 %，β-折叠链结构占27.51 %，β-转角结构占22. 99 %，无规则结构占21.28 %。与羊毛纤维的α-螺旋结构含量相比，提取羊毛角蛋白的α-螺旋结构含量较低。以LiBr为金属盐时，α-螺旋结构的含量最高，为28.23 %，还原剂为Na2S。其他还原剂与LiBr结合，α-螺旋结构含量依次递减，分别为NaHSO3（25.84 %）、Cys（23.20 %）、Na2S2O3（20.21 %）。以ZnCl2为金属盐时，α-螺旋结构的含量最高为26.46 %，还原剂为Na2S。其他还原剂与ZnCl2结合，α-螺旋结构含量依次递减，分别为NaHSO3（22.79 %）、Cys（17.48 %）、Na2S2O3（15.50 %）。
图7 (a) 萃取液pH值；(b) 氢键、盐式键、二硫键和肽键在不同pH值下的断裂强度。
通过分析羊毛纤维的溶解和羊毛角蛋白的提取结果，认为羊毛纤维的溶解和羊毛角蛋白提取效果与提取液的pH值、还原剂的还原性和金属盐的阴离子有关。还原剂和金属盐会导致不同的pH值，这是由还原剂和金属盐阳离子的酸碱度引起的。图 7a显示了不同溶液的pH值。其中，Na2S-Li体系pH值最高，pH值由高到低依次为Na2S-Zn、Na2S2O3-Li、Na2S2O3-Zn、NaHSO3-Li、NaHSO3-Zn、Cys-Li、Cys-Zn。一方面，还原剂对pH值有重要影响，Na2S体系在所有还原剂中属于强碱性；另一方面，金属离子的转化也有重要的影响。例如，Li+变成Li(OH)，Zn2+变成Zn(OH)2。氢氧化锂溶液比氢氧化锌溶液碱性更强，这是Na2S-Li体系存在强碱的主要原因。
不同pH值溶液对羊毛纤维的影响是不同的。羊毛纤维的等电点为4.8，当pH值高于等电点时（如：Na2S-Li、Na2S-Zn、Na2S2O3-Li、Na2S2O3-Zn等），溶液对氢键、盐式键、二硫键的破坏作用增强，有利于硫醇的生成和蛋白质链的破坏（图 7b）。当溶液的pH值等于等电点时（如NaHSO3-Li），羊毛的角质层收缩，盐式键变强，导致羊毛难以溶解，溶解率低（图 7b）。当溶液pH低于等电点时（如：NaHSO3-Zn、Cys-Li和Cys-Zn），氢键、盐式键、二硫键断裂较弱，羧基被质子化并与巯基交联，使羊毛角蛋白结构更紧密。
除pH值外，还原剂的还原性也会产生影响。其中Na2S的还原性最强，NaHSO3、Cys、Na2S2O3依次减弱。这也可以解释为什么Na2S体系的羊毛角蛋白产率最高，而Na2S2O3体系的羊毛角蛋白产率最低。
此外，α-螺旋结构的含量受金属盐阴阳离子的影响，主要原因为膨胀各向异性和超收缩动力学。α-螺旋结构的羊毛纤维在LiBr液中表现出各向异性的尺寸变化，从而引起尺寸变化。这种现象被称为超收缩动力学。收缩动力学分为两部分。第一部分纤维长度可收缩约25 %，第二部分纤维长度可收缩约30 %，这是由于LiBr对酪氨酸侧链氢键的破坏所引起的。当pH和温度相同时，阳离子和阴离子的收缩速率递减顺序为：Li+ > Na+ > K+和 I- > Br- > Cl-。除此之外，LiBr的活性比其他溶液更强。Li+可以表现出更小的体积和更强的极化能力。Cl-和Br-在Hofmeister序列中的位置不同，导致羊毛纤维在ZnCl2溶液中变得更稳定。这些条件可以促进锂离子与蛋白质极化基团的结合。因此，在LiBr溶液中可以得到更高的α-螺旋结构。
本文通过比较不同的羊毛角蛋白提取方案，发现我们优化的方法提供了极高的羊毛角蛋白提取率。用1.5 M Na2S， 0.3 M LiBr，0.02 M SDS溶解体系成功提取了α-螺旋结构丰富的再生角蛋白。由于适宜的pH值和金属盐，可以获得较高的羊毛溶解率、羊毛角蛋白提取率和α-螺旋结构含量。更重要的是，通过XRD、FTIR和EDS分析系统地研究了不同溶解体系对α-螺旋结构的影响。α-螺旋角蛋白基材料的可加工性可以通过提取方法开发高弹性和形状记忆材料，这使得该材料适用于广泛的生物工程和生物电子应用。
论文信息：Wang Y, Zhang T, Wang F, et al. Efficient Extraction of Wool Keratin Governed by Simultaneous Cation and Anion Effects: From Secondary Structure Studies to High α-Helix Keratin Content. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.4c0105（影响因子：8.4；中科院一区）
第一作者简介：王琰赐，兰州理工大学纺织工程系在读硕士；2020年毕业于兰州理工大学纺织工程专业本科。
