脂肪酸是生物体内合成的单元羧酸，其甘油三酯衍生物（俗称油或脂肪）是重要的生产和生活资料，除我们熟知的食用油外，甘油三酯也是食品、饲料、生物柴油和油脂化工等行业的重要原料。其中油脂化工的主要任务是对脂肪酸进行衍生化，所生产的许多油脂化学品可代替石化产品，且品质精良，并广泛用于家用化学品、个人护理、药物、橡胶、塑料，油漆和润滑剂等

还原脂肪酸为脂肪醇是高值化脂肪酸最重要的衍生反应之一，但由于羧基的化学惰性，脂肪酸需预先激活形成硫脂衍生物才能进行生物还原。典型的脂肪酸硫脂衍生物包括酰基辅酶A（Acyl-CoA）和酰基-酰基载体蛋白（Acyl-ACP），可通过还原酶催化形成脂肪醛和脂肪醇。而羧酸还原酶（Carboxylic acid reductase, CAR）是一类特殊的多功能酶，可直接利用脂肪酸为底物，其腺苷化结构域（Adenylation domain, A domain）催化羧酸底物与ATP反应生成酰基-AMP中间体，并将酰基转移到肽基载体蛋白（Peptidyl carrier protein, PCP）形成共价酰基-PCP硫酯中间体，该中间体再经还原酶结构域（Reductase domain，R domain）催化还原为脂肪醛。由于羧酸还原酶独有的特性，在脂肪酸衍生物微生物合成领域有重要的应用前景。

在前期再造酵母细胞工厂合成中链脂肪酸的基础上（Zhu et al. Nature Chemical Biology 2017, 13:360-362; Zhu et al. Nature Catalysis 2020, 3:64-74），针对羧酸还原酶底物特异性差的缺点，为提升该酶选择性还原中链脂肪酸的能力，本研究组合多种蛋白质工程手段对羧酸还原酶进行了改造和设计。包括（1）非理性定向进化，利用羧酸还原酶有利于缓解中链脂肪酸细胞毒性这一特点，设计与生长偶联的富集手段，对该酶的随机突变文库进行筛选，可获得更好突变体；（2）理性定点突变，通过比较不同酶腺苷化结构域的底物口袋，找到了控制底物链长的特定氨基酸残基I303，突变该氨基酸为大侧链色氨酸，可使酶的底物口袋变小，催化中链脂肪酸的活性增加；（3）半理性设计，针对还原酶结构域中由三个氨基酸残基（C983–M985）组成的开关序列，采用定点饱和突变加富集筛选，也可获得活性提高的突变体；（4）结构域替换和增添，针对羧酸还原酶只能特异性催化2e-还原，替换原有还原酶结构域为可催化4e-还原的异源还原酶结构域，没有取得理想效果，然而增添一套4e-还原的异源还原酶结构域，也可使脂肪醇合成能力提升；（5）部分突变位点的组合，显示出协同和叠加效果。本研究设计和改造羧酸还原酶，使其催化转化中链脂肪酸的能力显著提升，为利用该酶合成中链脂肪醇及其衍生物提供了基础。

该研究由我院朱志伟教授与瑞典查尔姆斯理工大学Jens Nielsen教授（中国工程院外籍院士）、奥地利格拉茨理工大学Margit Winkler博士等合作完成。朱志伟教授在项目提出、实验设计、数据获取与分析、项目合作协调等方面均有重要贡献。相关论文近日发表在权威综合类杂志《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS），瑞典查尔姆斯理工大学胡雅婷博士和朱志伟教授为论文的共同第一作者。

全文链接：

Hu Y, Zhu Z, Gradischnig D, Winkler M, Nielsen J, Siewers V: Engineering carboxylic acid reductase for selective synthesis of medium-chain fatty alcohols in yeast. Proc Natl Acad Sci USA 2020:202010521.

https://www.pnas.org/content/117/37/22974.short