文章链接：https://doi.org/10.1002/adhm.202202207
李鹏教授课题组关于抗体-抗微生物偶联物综述发表于Advanced Healthcare Materials（Imapct Factor:10.6）。本文第一作者为西北工业大学柔性电子研究院博士生余骆峰，李鹏教授为本文通讯作者。
摘要：由于新抗生素的开发远远落后于耐药细菌的出现，迫切需要解决这一困境的替代策略。抗体-药物偶联物是一种很有前途的治疗平台，可以精确地将细胞毒性有效载荷递送到靶细胞，用于有效的疾病治疗。抗体-抗微生物偶联物（AACs）最近引起了研究人员的极大兴趣，因为它们可以靶向靶位点的细菌，提高药物的有效性（即减少药物剂量和不良反应），缓解抗微生物耐药性的激增。
【介绍】
20世纪上半叶，青霉素的发现和临床应用开创了抗生素的黄金时代。这是一个伟大的成就。然而，抗生素的过度使用和滥用引发了细菌的不断进化变化，并导致耐药性的快速出现。即使是最近上架的第四代和第五代头孢菌素类抗生素，在临床应用中的治疗作用也开始减弱。多重耐药细菌引起的感染已成为医学领域的严重威胁。据估计，如果不采取有效行动，到2050年，耐药细菌将造成1000万人死亡，这可能比癌症造成的死亡人数还要多。虽然研究人员和制药公司被促使开发新的抗生素，但开发新药的过程既耗时又昂贵。新型抗生素开发滞后，无法跟上耐药性感染日益增长的需求。迫切需要替代策略来对抗日益恶化的抗生素耐药性临床状况。
将药物与功能分子偶联是提高药物性能的一种通用有效策略。例如，与聚合物偶联的治疗蛋白可延长半衰期，与生物活性配体偶联的铂基药物可提高疗效和降低细胞毒性。抗体因其对靶抗原的高度特异性而引起了研究人员的极大兴趣。因此，开发能够与抗体结合的药物是一种新的靶向治疗方法。
在过去的二十年里，抗体-药物偶联物（ADC）已被证明具有有效的治疗作用，并对严重疾病的临床治疗做出了重大贡献，特别是在肿瘤学和血液学方面。自2000年美国食品药品监督管理局批准第一种ADC用于治疗急性髓系白血病以来，迄今为止，美国食品药品管理局已批准12种ADC，其中8种用于实体瘤，4种用于血液肿瘤。近年来，也有大量关于ADC治疗癌症以外的感染性疾病的报告，如神经系统疾病、类风湿性关节炎、和我们在本综述中重点关注的病原菌感染。
鉴于抗体的高度特异性，抗体-抗菌偶联物（AACs）能够以高选择性靶向细菌。AAC能够携带抗微生物剂到所需的感染部位进行有效的治疗，同时减少抗生素的数量和不良反应，从而减轻耐药性的增加。与单独的抗微生物剂相比，抗体偶联物的毒性较小，通常针对某些致病物种，从而避免了对自然微生物群落的破坏。然而，针对细菌感染的AACs的开发仍处于初级阶段。目前，对AACs药物的构建策略、实施效果和应用前景等方面的综述较为系统。在此，我们全面总结了近十年来AACs在抗细菌感染方面的最新进展。
我们首先介绍各种各样的抗体和它们的特定靶标。抗菌有效载荷包括抗生素、抗菌肽(AMPs)和纳米颗粒(NPs)。还强调了基于半胱氨酸、赖氨酸、非典型氨基酸、典型氨基酸、生物催化和偶联连接物的位点特异性偶联策略。最后列举了近年来AACs在抗菌方面的最新进展，并对其应用前景进行了展望。
【AACs抗体】
1901年，第一个诺贝尔生理学或医学奖授予了Emil von Behring和Shibasaburo Kitasato，以表彰他们在白喉杆状杆菌和破伤风梭菌的血清治疗方面的杰出贡献。人们随后意识到血清治疗在病毒和细菌感染中的预防和治疗潜力。然而，自20世纪30年代以来，随着抗生素的发现和兴起，血清疗法逐渐消失。由于青霉素在第二次世界大战中被广泛用于预防感染，抗生素的发展得到了推动，抗生素可以大规模生产，并且可以以低成本获得。抗生素的滥用和过度使用已导致致病菌，包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌)·和肠杆菌物种(也称为ESKAPE)产生持续耐药性。变异的细菌会降低抗生素的治疗效果，导致更顽固的细菌感染。AACs被认为是抗生素的有效替代品，其中AACs基于特异性细菌抗体精确靶向致病菌。这些细菌特异性抗体主要针对细菌细胞壁上的成分，根据结构差异可分为三类:表面蛋白、脂多糖和壁酸(图1)。部分选定的细菌特异性抗体及其靶标列于表1。
图1 细菌细胞壁上潜在的抗体靶向位点
表1 现有的细菌特异性抗体及其靶标
抗体首先靶向致病菌表面的关键蛋白质，从而阻止蛋白质发挥作用，同时对细菌毒性产生抑制作用或通过免疫系统启动细胞消除。在铜绿假单胞菌引起的肺损伤和败血症的病例研究中，疾病的分期在很大程度上取决于III型分泌系统的毒力。表面蛋白PcrV是编码导致该传染病的III型毒素递送的蛋白质。从铜绿假单胞菌感染的小鼠中分离出的抗体Mab 166对感染20倍致死剂量细菌的动物模型显示出保护作用。在对抗金黄色葡萄球菌的斗争中，单克隆抗体514G3可用于靶向金黄色葡萄菌细胞壁蛋白A（SpA）逃逸机制的关键成分，该蛋白可以通过SpA片段可结晶（Fc）区结合捕获大多数免疫球蛋白亚类，以伪装和逃避Fc介导的系统体液免疫。与上述其他免疫球蛋白亚类不同，单克隆抗体514G3的抗原结合片段（Fab）可以识别并结合SpA上的独特表位，使Fc暴露于介导金黄色葡萄球菌的吞噬作用。
抗体还能特异性识别细菌多糖，促进细菌灭活。从炭疽保护性抗原联合耐药肺炎克雷伯菌荚膜多糖(CPS)接种小鼠中分离的抗体17H12和8F12是该机制的代表性抗体。这两种抗体可结合肺炎克雷伯菌CPS上的寡糖表位，破坏其生物膜形成能力，激活补体沉积，促进小鼠巨噬细胞和人中性粒细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬和胞内杀伤。同样，从感染高毒性鲍曼不动杆菌的小鼠中获得的抗体C8通过细菌灭活机制起作用。该抗体靶向鲍曼不动杆菌CPS，促进调理吞噬作用。人源化C8单克隆抗体在小鼠和人巨噬细胞中均保持其作用。它保护小鼠免受致命感染。
除了上述机制外，抗体还可以靶向壁磷壁酸（WTA）。抗体和WTA结合的分子动力学表明，它们在相互结合时符合两个原则：1）与β-GlcNAc吡喃糖核结合；2）WTA磷酸残基与极性接触的三角测量。揭示了靶向金黄色葡萄球菌表面独特表位的分子基础。Lehar等人从40名感染金黄色葡萄球菌的患者中筛选出一组抗金黄色葡萄杆菌特异性抗体。他们检测并验证了一种先导抗体（THIOMAB）可以特异性结合所有测试的金黄色葡萄球菌菌株的WTA
抗体依赖疗法具有以下优势:1)与抗生素靶向细菌生存蛋白不同，单克隆抗体(mAb)对病原体表面的蛋白质具有高度特异性，有效地限制了耐药性的发展;2)与抗生素的广谱抗菌特性不同，单抗的高特异性使其在进入人体血液循环后，避免对非靶向细菌的菌落和细胞产生不必要的影响，避免对体内微生物群落的破坏;3)抗体疗法的使用可以有效地减少传统抗生素的剂量
【AACs抗菌药物】
在抗体偶联物中，抗体通常用于靶向目的，将附着的有效载荷像“导弹”一样输送到所需的位点。抗体可以靶向细菌毒素、多糖、或表面蛋白。在所需的位点，抗体的主要作用完成，然后有效载荷将发挥其作用。抗体偶联物可以通过偶联抗微生物剂来实现针对致病菌的靶向治疗。在本节中，我们讨论了各种抗菌剂的抗菌机理，这些抗菌剂已被证明并投入使用，包括之前报道的实例。由于存在不同类型的抗菌剂，它们被进一步分类为抗生素、抗菌肽、抗菌NP等（表2）。我们还对一些不常见或新型抗菌剂的应用前景提供了见解。
表2 抗菌剂在抗体偶联物中的作用
3.1、抗体
抗生素抑制细菌DNA、RNA、细胞壁或重要蛋白质的合成。然而，细菌通过DNA突变迅速进化产生耐多药，导致“超级细菌”的出现。抗体-抗生素结合物是对抗“超级细菌”的新平台。抗体-抗生素结合物可以避免有益共生体的非靶向消除，并且已被证明在治疗细胞内感染方面是有效的。通过整合传统抗生素的优点，包括优越的吸收、分布、代谢和消除特性(即清除缓慢和半衰期长)，该偶联物具有增强的治疗效果。
THIOMAB抗体-抗生素偶联物是一种基于人免疫球蛋白G1 (IgG1)的工程抗体，在特定位点上含有活性半胱氨酸残基。它允许抗生素以特定的化学计量比结合而不破坏链间二硫键。THIOMAB技术可以靶向金黄色葡萄球菌，并以更均匀的化学计量来解决异质性问题。Lehar等人将利福霉素衍生物与抗微生物单抗结合，该单抗可破坏细胞外耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。该结合物对细胞内金黄色葡萄球菌治疗菌血症的效果优于万古霉素。目前，基因泰克股份有限公司已经开发并进行了一种抗体-抗生素结合物前药的临床试验，该前药靶向细菌WTA，以消除小鼠体内的细胞内金黄色葡萄球菌。Meeker等人证明，负载抗生素（达托霉素）的金纳米笼和靶向金黄色葡萄球菌脂蛋白的抗体之间的结合可以有效杀死高抗生素耐药性MRSA生物膜。使用相同的方法，他们用庆大霉素取代负载的抗生素，并将其与外膜蛋白靶向抗体偶联，对铜绿假单胞菌生物膜造成高致死性。
3.2、抗菌肽
AMP由于其独特的两亲性结构而具有广谱抗菌活性，并且由于其独特的抗菌机制而具有较低的诱导抗生素耐药性的倾向。AMPs的抗感染机制被推断为直接破坏细菌，Mookherjee等对此进行了清晰的解释。病原菌对常规抗生素的耐药性迅速增长，使AMPs成为一类新的抗感染药物。除了抗菌活性外，已知amp还能够调节免疫反应，促进伤口愈合，防止术后粘连。然而，AMPs选择性差引起的全身毒性一直是AMPs的固有缺点。AMPs与抗体的结合为开发靶向特异性药物递送系统提供了一种潜在的方法，增强了AMPs用于抗菌治疗的靶向功能。
Brogden等人通过马来酰亚胺连接剂将SMAP28肽与牙龈假单胞菌表面特异性兔IgG抗体偶联，可在人工生成的微生物群落中特异性杀灭牙龈假单胞菌。这一策略有很大的潜力应用于其他系统，以消除牙周病患者甚至其他疾病的其他病原体，同时避免损害正常的微生物群。Touti等人将靶向革兰氏阴性菌核心脂多糖聚糖的IgG与AMP结合，制备了一种抗体-杀菌大环肽偶联物，该偶联物在低浓度下可轻易杀死大肠杆菌，且溶血活性极低。
由于宿主细胞保护细胞内细菌不受抗生素的攻击，因此抗生素的渗透性差导致细胞内浓度不足从而很难消灭细胞内细菌，。然而，一些AMP(如LL-37)能够通过直接穿透细胞或内吞作用转移到细胞内，有效杀死细胞内细菌菌株，包括金黄色葡萄球菌和分枝杆菌。AMPs与靶向功能抗体偶联在治疗细胞内细菌感染方面具有广阔的应用前景。
3.3、 抗菌纳米颗粒
NP由于其独特的物理和化学性质，包括其大的比表面积和表面功能化能力，使其能够与微生物膜密切相互作用，已被广泛报道为对抗抗微生物耐药性的创新工具。纳米粒子的表面功能化是设计抑制病原体生长的抗菌材料的有效方法。生物大分子，特别是抗体，已经与NP结合，以实现协同抗菌效果。抗体与NP的结合结合了抗体对抗原的选择性识别能力与NP的固有特性（例如，药物包封、热或磁特性），从而提高了细胞内的细胞摄取和稳定性。马等人制备了与壳聚糖纳米粒子偶联的特异性蛋黄抗体（IgY），用于选择性靶向和治疗胃肠道中产生志贺毒素的大肠杆菌。
金属NPs的抗菌活性得到了广泛的研究。银NPs (AgNPs)已被证明对大肠杆菌、淋病奈瑟菌和沙眼衣原体等病原微生物具有较强的抑制和杀伤作用。到目前为止，AgNPs可能被认为不会引发耐药性，并已被广泛用作抗菌剂。它们固定在细菌的细胞壁上，破坏细胞膜，导致细胞内容物渗漏。抗体AgNPs偶联物可以靶向特定细菌，但也可以结合先进的抗菌技术，如光动力抗菌疗法。除AgNPs外，金NPs也具有令人满意的抗菌活性，具有广阔的应用前景。AuNPs可以制备成不同形状（即球形、杆状和笼状）和大小，有助于与抗体结合。然而，AuNPs的毒性仍然是生物医学应用关注的问题。值得注意的是，与抗体结合的AuNPs具有优异的光热治疗性能。金纳米棒抗体偶联物对铜绿假单胞菌的破坏可以通过近红外(NIR)辐射进行监测。Millenbaugh等人证实AuNPsantibody联合脉冲激光照射是对抗金黄色葡萄球菌感染的有效措施。激光照射后MRSA群体存活率明显下降，而未经过激光照射的功能化NPs抗菌效果不明显。Mocan等人也利用IgG抗体功能化AuNPs，利用激光照射在体外实现了选择性光热MRSA治疗。
NPs可以延长偶联抗生素的半衰期，并可作为缓释系统使用，以减少给药频率。Ghanbar等人成功地将含有非选择性杀菌剂的脂质NPs与mrsa靶向抗体偶联。结合物实现了靶向递送和持续释放杀菌剂到MRSA感染部位。Zhang等制备了含有抗生素(环丙沙星)的pH和细菌酶应答自组装NPs，并将其与细胞间粘附分子-1抗体偶联。结合物根据微环境变化在感染部位释放抗生素，实现脓毒症的控制和管理。本研究在基于NPs的给药系统开发方面取得了重大进展。
3.4、其他抗菌剂
携带胍或季铵的聚合物具有不同程度的抗菌作用，如季铵化聚(2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯)。已知这些聚合对哺乳动物正常细胞的毒性很小。它们通常通过“接枝”方法在表面原位聚合，从而方便地与抗体结合。此外，抗菌聚合物有望具有延长抗体半衰期和降低抗体免疫原性的功能，为抗体偶联物提供一种替代的抗菌剂。
【AACs的共轭策略】
研究在抗体和抗菌剂之间形成“基本键”的偶联策略是制备AACs的关键。不同的负载能力和缀合位点造成了缀合物的异质性，随后在体内产生了广泛的药代动力学。位点特异性偶联可以通过控制抗体和抗菌剂的结合形式和各自的性质来实现AACs的稳定性和均匀性。一般来说，抗体偶联策略可分为以下几种:通过半胱氨酸、赖氨酸、非典型氨基酸、典型氨基酸和生物催化偶联(图2)
图2 AACs偶联策略
4.1、基于半胱氨酸结合
半胱氨酸在抗体中出现的频率较低。半胱氨酸侧链上的巯基（-SH）是亲核的，这是其结合的必要条件。已报道的基于半胱氨酸的缀合策略如图3所示。通常，抗体中半胱氨酸残基形成的二硫键可以被二硫苏糖醇或三（2-羧乙基）膦还原，产生游离巯基，该巯基通过Michael加成与反应性马来酰亚胺反应。反应发生在冰浴中pH为7-8的温和条件下，可以在短时间内（约1小时）完成。上述THIOMAB技术是基于抗体上半胱氨酸残基与马来酰亚胺的反应性开发的。
最近，Coumans等人报道了磺化三苯基膦作为半胱氨酸的选择性还原剂，同时保持抗体链间二硫键的氧化状态。与需要纯化的传统氧化还原工艺不同，这种方法可以在没有杂质的情况下制备ADC。Darwish等人在特定pH下通过Fab处的半胱氨酸将马来酰亚胺去官能化的纳米脂蛋白颗粒与抗体偶联。该组件可用于多价形式的Fab定向递送，并与现有的制造工艺兼容。然而，硫醇-马来酰亚胺加成的可逆反应将导致毒力因子的损失并引起细胞毒性（图4a）。
幸运的是，这种情况可以通过五元环硫代丁二酰亚胺的水解来改善，因为快速的水解反应抑制了解偶联过程(巯基-马来酰亚胺加成的逆反应)。Lyon等人利用二氨基丙酸制备了一种药物连接剂，用于巯基琥珀酰亚胺环的定点催化水解，从而防止了负载的不期望去除，提高了adc在血浆中的稳定性(图4b)。Christie等人在苯环中引入吸电子基团，通过共振离域促进n -芳基马来酰亚胺水解，形成稳定的抗体偶联物，同时保持较高的偶联效率。此外，半胱氨酸的二硫键可以通过二溴马来酰亚胺作为偶联位点。这种策略已经在二硫键与马来酰亚胺、双砜和吡嗪二酮的偶联中得到了证明。最近，有报道称二硫重桥策略通过二酰三嗪的半胱氨酸钉接能力来修饰单抗。有趣的是，生物聚合物中的亲电二硫键、二硒化物键和混合Se-S键也被报道能够直接取代芳香的C-H键。通过该策略，制备了HER2靶向IgG和染料木素的偶联物。代表了半胱氨酸偶联策略的突破，为未来提供了新的可能性。
图3 基于半胱氨酸的偶联策略综述
图4
a ADC中药物连接体片段的非靶向释放诱导脱靶毒性。
b 采用不同侧链的药物连接物库来提高adc的稳定性。
4.2、基于赖氨酸的结合
赖氨酸偶联是一种常用的抗体偶联方法。一个典型的抗体上大约有80个赖氨酸残基，其中大约有10个可以化学连接。活化羧酸与胺通过酰胺键结合是有机合成中最有效的化学转化之一。早期adc是通过将暴露的抗体赖氨酸残基与小分子异硫氰酸酯(NCS)、n -羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯、酸酐、氟苯酯、活性内酰胺等连接，以异构方式制备的(图5)。目前已获FDA批准的两种adc都是通过赖氨酸-胺偶联偶联的，分别是gemtuzumab ozogamicin和ado-trastuzumab emtansine。
传统的赖氨酸抗体偶联选择性较差。使用NHS酯会与酪氨酸发生交叉反应，造成严重的异质性。此外，一些在抗体-抗原相互作用中起决定性作用的赖氨酸残基可能通过该策略被修饰，导致结合亲和力降低，治疗指数较差。因此，探索更具选择性的赖氨酸残基偶联策略至关重要。以1,4,7,10四氮杂环十二烷-N,N '，N″，N′-四乙酸(DOTA)类似物为例，利用酸酐将人源化单抗与DOTA偶联合成。环酸酐是生物偶联的有力工具。室温下与赖氨酸残基的偶联只需30分钟即可完成。此外，内酰胺功能化是一种经常用于与赖氨酸位点结合的策略。Hwang等人开发了一个内酰胺功能化的小分子，可以在人源化的催化抗体h38C2中选择性地与Lys99残基的-氨基形成稳定的酰胺键。这允许芳香化进行生物偶联。同样，含有抗病毒类似物的活化ε-内酰胺和内酰胺功能化的siRNA也可用于选择性地偶联抗体的赖氨酸残基。
4.3、基于非经典氨基酸的共轭
通过基因编码将非规范氨基酸引入抗体并在特定位置实现化学偶联是提高抗体偶联物均匀性的另一种常用策略。Schultz等人开发了一种蛋白质表达系统，该系统成功地将大量含有酮、醛、叠氮化物、炔、烯、芳酰卤化物等功能成分的非规范氨基酸导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中(图6)。它是一种新兴的蛋白质位点特异性修饰技术，具有巨大的潜力。Schultz等人首先通过蛋白表达系统设计了一种含有对乙酰基- l-苯丙氨酸残基的抗体。然后羰基通过烷氧胺功能化的auristatin反应形成肟键。Zimmerman等人利用无细胞表达系统将对叠氮多甲基- l-苯丙氨酸编码为IgG曲妥珠单抗，与HER2受体结合，随后通过叠氮-炔环加成的无铜点击化学将抗体与二苯并环-环-聚乙二醇单甲基auristatin F偶联。此外，Addy等人在大肠杆菌中编码非规范氨基酸5-羟色氨酸，使其能够与几乎任何蛋白质结合。这种生物偶联策略已被荧光基团偶联物证明。在他们后来的工作中，同一个研究小组还成功地将三种不同的非规范氨基酸同时结合到蛋白质中。除了偶联作用外，这些非规范氨基酸还可以实现重组蛋白的位点特异性标记。
Yang等通过SEP正交翻译体系将o -磷酸丝氨酸(SEP)掺入重组蛋白中，将SEP去磷酸化生成脱氢丙氨酸(Dha)进行双正交反应。通过锌和铜的起始，通过化学选择性C-C键将烷基碘形式的部分与Dha偶联进行翻译后修饰。该团队还成功构建了多种具有不同位点特异性修饰的蛋白质变体，并证明该方法可以扩展到生产具有不同形式化学修饰的设计蛋白质，即糖基化氨基酸和磷酸酪氨酸。
图6 各种具有不同性质的非经典氨基酸被结合在一起
4.4. 基于规范氨基酸的偶联
虽然可以通过基因突变将功能氨基酸掺入以产生理想的官能团和活性结合位点但很费力。这促使人们探索非常规的氨基酸偶联位点。对于亲核性较低的氨基酸，如色氨酸、组氨酸、精氨酸、蛋氨酸和酪氨酸，已经积极开发了有前途的偶联策略。
Cong等人在peg -双砜和c端6个his标签的抗体(dAb-His6)之间引入了一种相对简单的位点特异性PEG化。然而，聚乙二醇化的化学计量学还没有明确定义。Lin等人报道了一种通过氧化还原反应进行化学选择性蛋氨酸生物偶联的策略。在一系列生物相容性反应条件下，利用恶氮吡啶基试剂实现了快速、稳健的蛋氨酸偶联。由于蛋氨酸是脊椎动物中第二稀有的氨基酸，而且表面可接近的蛋氨酸有限，因此这是一种高选择性的抗体偶联策略。此外，酪氨酸的芳香侧链是疏水的，可以参与与酚羟基存在的氢键。或者，它可以形成允许电子转移的酪基自由基。在过去的15年中，一系列的双正交偶联策略被报道用于功能化酪氨酸的酚基。酪氨酸偶联已在一系列重要的生物分子中得到有效证明，包括ADC、荧光探针、蛋白质聚集体和PEG偶联物。最近，Sato等人利用辣根过氧化物酶在单电子转移条件下催化暴露在表面的酪氨酸残基的修饰，修饰的抗体被用于体内成像和ADC。
4.5. 生物催化结合
上述化学偶联方法是基于不同种类氨基酸的官能团。通过生物催化偶联也是蛋白质和抗体的常见偶联策略。生物催化偶联最常见的表现形式是内部介导的蛋白连接和分选酶介导的蛋白连接。
内含子是前体未成熟蛋白中的一种自剪接多肽链。Lopez等人设计了一种毒素内毒素抗菌剂，通过切割和组合工程毒素，可以杀死混合细菌群中的抗生素耐药性霍乱弧菌。考虑到内含子的蛋白质特性，它们的掺入可能导致融合蛋白缺乏表达，限制了抗体的广泛应用。分选酶是一种存在于许多革兰氏阳性细菌细胞膜中的转肽酶。如图7所示，s或tase A可以识别蛋白质c末端的氨基酸序列LPXTG (X = D, E, A, N, Q或K)。它切割苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间的键，并将苏氨酸残基的羧基与低聚甘氨酸(如Gly5)的n端连接，催化肽转移。Kornberger和Skerra在分选酶A的催化下，将经临床验证的曲妥珠单抗αHER2 Fab与植物毒素gelonin偶联，从而制备了一种转化率为50%的新型免疫毒素。最近，Greineder等人将sortase A的识别基序引入内皮特异性单链抗体片段(scFv) c端。他们进一步将含有短氮偶联氨酸的肽(G3-peptide-N3)连接到scFv上，实现了与治疗剂的位点特异性点击偶联
除了上述方法外，一种突变的内糖苷酶被证明可以有效地用于制备含有均质糖蛋白的位点特异性adc。Tang等人利用该酶在糖工程中的转糖基化活性，将预合成的均相n -聚糖底物与IgG偶联。所得adc稳定，产率高，均匀性好。这一策略使得利用天然抗体作为直接偶联的原料成为可能。
图7 分选酶介导的连接
【AACs的共轭连接物】
在抗体偶联物中，连接物将有效载荷（抗菌剂）与mAb连接。连接体的设计和优化对于AACs的发展以追求高靶向性和治疗指数是重要的。连接子在维持偶联物的化学稳定性（即药代动力学和药效学）和限制脱靶毒性方面发挥着至关重要的作用。抗菌剂过早释放可导致全身毒性和低治疗指数。连接子选择广泛参与生物缀合领域，如肽-抗生素缀合和双功能杂交抗生素。AAC的连接子通常分为可裂解连接子和不可裂解连接体（表3）
可裂解连接体含有可根据环境条件改变的元素，使其能够在特定情况下裂解。它们通常包括溶酶体蛋白酶识别的肽基序、在酸性pH下可水解为醛和酮的腙键或可被谷胱甘肽还原的二硫键。DSTA4637S是单克隆THIOMAB人IgG1和利丰霉素类抗生素dmDNA31的偶联物，通过蛋白酶可切割的连接物连接，靶向并杀死细胞中的金黄色葡萄球菌。该连接剂由马来酰亚胺基、缬氨酸-瓜氨酸二肽和对氨基氨基苄氨基甲酸酯或对氨基氨基苄季铵间隔剂组成。当这些细菌进入细胞内环境(如吞噬溶酶体)时，宿主蛋白酶(如组织蛋白酶)会裂解连接体并容易释放抗生素。Park等利用PH敏感的马来酰亚胺连接剂，通过切割腙基团选择性释放药物。此外，该连接剂可用于环丙沙星的选择性递送和控释。
通过不可裂解的接头卸载药物的机制是基于抗体偶联物的蛋白质降解。当mAb和连接体被分解时，连接到连接体的赖氨酸或半胱氨酸残基的有效载荷被释放。不可裂解的连接体通常涉及作为端基或交联体的特殊官能团（例如，琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸酯（SMCC）辅助的emtansine（DM1）和连接到MMAF的马来酰亚胺原酸）。IgG-SMAP28是在交联剂SMCC的帮助下通过控制蛋白质-蛋白质交联试剂盒的抗体-肽缀合物。PEG也被广泛用作连接体。短链PEG可用于连接连接基团（即马来酰亚胺[MAL]和琥珀酰亚胺基羧甲基酯[SCM]）以形成交联剂（MAL-PEG-SCM）。MAL-PEG-NHS，一种异质双功能连接体，也可以通过连接NHS酯和PEG来构建，实现巯基和氨基的化学偶联。
表3 普通连接体用于构建抗体偶联物
【AAC的应用】
由于抗体上的抗原识别区(Fab片段)具有高度特异性，抗体偶联物可以准确地将有效载荷传递到目标细菌表面。抗体偶联物在病原菌检测和感染后治疗方面显示出巨大的抗菌应用潜力。本节将重点介绍抗体偶联物的应用研究进展
6.1、致病菌是引起传染病的主要原因之一
及时检测食品和环境中的致病菌，可以有效预防传染病的发生。目前的检测方法受到高检测限(产生反应的最低浓度)的限制。由于细菌可以迅速繁殖，无法在低于检测限的浓度下检测到细菌会造成严重的健康风险。因此，迫切需要快速、高灵敏度的检测方法来有效避免细菌感染。
磁性纳米粒子(MNPs)的磁性为细菌的检测和分离提供了良好的来源，因此在生物医学领域越来越受欢迎。利用抗体- MNPs偶联物开发用于检测、分离和治疗致病菌的生物传感器和生物导弹是一个新兴的趋势。Barroso等人开发了一种结合三明治免疫测定和磁阻生物芯片的便携式肺结核诊断方法。将抗结核分枝杆菌抗体与MNPs结合，通过免疫反应捕获结核分枝杆菌。将预先制备的磁阻生物芯片与二抗结合，在磁作用下制备出用于检测的生物传感器。通过在磁阻芯片上表达特异性结合与非特异性结合的信号差异，实现结核病的实时检测。表面增强拉曼散射(SERS)光谱反映分子结构信息，可用于分析不同细菌独特的细胞壁组成。Wang等人报道了一种磁辅助SERS生物传感器。SERS标记与MnFe2O4@Au-antibody连接，分离检测金黄色葡萄球菌，检出限可达10个细胞/mL。该偶联物分别被抗体和MNPs赋予特异性和磁性，实现了对特定目标细菌的捕获和分离。
抗体和抗原之间的特异性免疫反应也引起了人们对病原菌检测方法的关注。Kong等人开发了一种基于单克隆抗体的间接竞争性酶联免疫吸附测定法(ic-ELISA)和免疫层析测定法，以高灵敏度和准确性快速检测食品和饲料样品中的呕吐毒素。ELISA法对细菌的检测受到其检出限的限制，特别是当细菌浓度低于其标准检出限时。电化学免疫传感器通过对抗原的免疫反应检测电流、电容和电导的变化，操作简便，灵敏度高。Wang等人将肺炎球菌表面蛋白A与固定在金电极上的DNA中空四面体结合，用于早期肺炎球菌感染的检测。在牛血清、大肠杆菌裂解液、口鼻腔等复杂环境中均可成功实现较低的检出限。
在生物医学和食品应用中，在较早的时间检测低浓度的细菌是很重要的。早期发现有助于防止药品和食品变质或变质，最终抑制感染暴发。综上所述，目前对缀合物的研究主要集中在利用抗体与抗原之间的特异性识别或免疫反应作为细菌高灵敏度检测和分离的基础。结合磁电阻、光谱学和电化学技术实现了细菌的实时检测，提供了快速、准确、方便的细菌识别、捕获和/或定量。
6.2、用于抗菌素治疗的AACs
AACs通过在所需位点精确地携带和释放杀菌有效载荷来实现抗菌药物的靶向递送。金黄色葡萄球菌在入侵后可能隐藏在宿主细胞中以保护自己免受抗生素的侵袭。细菌可在细胞内增殖并介导细胞间转移，引起感染复发和治疗困难。有效清除细胞内细菌是临床成功治疗细菌感染的关键。基因泰克的研究人员将抗体和抗生素(利福霉素)结合起来，用于细菌的表面附着。当偶联物进入细胞内细菌时，蛋白酶会裂解连接物释放抗生素并杀死细菌(图8)。与游离的利福霉素和万古霉素相比，这些偶联物可以有效地消灭细胞内细菌并阻止其在宿主细胞之间转移。
在设计抗体-抗生素偶联物时，考虑它们在血液中的稳定性是至关重要的，这可以确保它们的半衰期长，并避免非特异性释放到正常细胞中。除利用感染性微环境触发抗菌剂释放外，还可通过外部诱导发挥抗菌活性。AuNPs具有可控的几何和化学性质，在医药领域的开发备受关注。它们在近红外区有很强的吸收。
Mocan等人构建了用于MRSA选择性杀菌的IgG AuNPs。一旦偶联物到达感染部位，这些NP将在近红外辐射下以剂量依赖的方式被激活，将光子能量转化为热量，从而破坏细菌膜结构，从而抑制感染的发生（图9）。
壳聚糖纳米粒子无毒、生物相容、可生物降解。最重要的是，壳聚糖纳米粒子具有正电荷，可以在酸性环境中破坏细菌的细胞壁，但对正常细胞没有毒性和副作用。考虑到上述情况，壳聚糖纳米粒子经常被用作抗菌剂。马等人将壳聚糖纳米粒子与抗大肠杆菌抗体偶联，并证明其在体内有效杀死杆状线虫胃肠道中的大肠杆菌，而不会影响其他非靶向细菌。值得注意的是，利用壳聚糖NP的一个非常有利的原因是，它们不需要任何生物酶或外部作用来激活抗菌剂，但在抑制靶向细菌的同时不会影响正常细胞和非靶向细菌
AACs的抗菌治疗可以被描述为向我们的身体发射“生物导弹”。AACs借助抗体的特异性靶向作用，通过血液循环准确定位目标细菌，随后将抗菌药物激活并释放到目标部位，完成抗菌过程。与游离小分子治疗相比，AACs显著降低了感染部位的不良反应，提高了抗菌药物的生物利用度。简而言之，AACs作为下一代抗菌系统具有很大的潜力。
图8 抗体-抗生素结合物消除细胞内细菌和阻断细菌细胞间传播的机制
图9 a) AuNP-TA-IgG生物纳米复合材料的合成方案示意图
b) AuNP-TA-IgG近红外激光诱导治疗MRSA示意图
【结论与展望】
总之，AACs是延缓抗生素耐药性的有力工具，在临床治疗中具有不可估量的潜力。理想的AAC由特异性靶向抗体、强效杀菌载荷和高偶联率的连接体组成。在这三种成分中，抗体的选择至关重要，它决定了AACs的导引作用，选择性地靶向致病微生物而非哺乳动物细胞。
对于杀菌有效载荷，可以使用大量具有优异生物活性的候选抗菌药物(即抗生素，amp, NPs和聚合物)，从而扩大AACs的库。就连接体而言，可分为可切割连接体和不可切割连接体两种类型。不可切割的连接体可以确保AACs在复杂的等离子体循环中的稳定性。相反，对特定环境敏感的可切割连接体更有可能响应性地释放由感染微环境触发的抗菌药物。合理设计的AACs具有高选择性实现和灭活细菌的能力，从而降低不良毒性，提高单位活性，使未分化的抗菌药物恢复活力
尽管已有相当多的研究报道其制备的AACs能够有效地实现靶向抗菌活性，但其临床转化仍有很长的路要走。AACs商业化的主要挑战如下:1)偶联物的生物降解性问题，2)偶联物的体内性能，以及3)偶联物对靶向能力和抗菌活性的影响(即与原始抗体和抗菌药物相比)。此外，药物抗体比是关系到AACs疗效和安全性的重要因素。此外，具有两种不同类型抗原结合片段的双特异性抗体在构建晚期AACs方面具有很大的前景。与目前研究中最常用的全长抗体相比，纳米体和单链抗体等小抗体片段在构建AACs方面具有显著优势，具有更好的循环动力学、组织渗透能力和免疫原性，同时也可以避免fc介导的抗体依赖性增强效应。这些抗体可能在未来制造下一代AACs方面具有很大的潜力，并为临床转化提供了机会。