纳米流体是探索离子、分子通过纳米级通道传输行为的新兴热点领域，具有广阔的应用前景。然而，通过纳米流体装置在单分子水平上原位探测功能蛋白的生物活性尚未见报道，这仍然是该领域的一大挑战。

而来自中国科学院长春应用化学研究所的金永东研究员最近于ACS Nano上线了一篇文章：Photoactivated Bacteriorhodopsin/SiNx Nanopore-Based Biological Nanofluidic Generator with Single-Protein Sensitivity，该工作报道了一种基于天然质子泵蛋白、细菌视紫红质 (bR) 和单个 SiNx 纳米孔的具有单蛋白敏感性的生物纳米流体装置，实现了对 bR 质子泵活性及其光响应的纳米流体单分子探测。

细菌视紫红质(bR)是一种天然的光驱动质子泵蛋白，以脂质介导的三聚体形式嵌入紫膜。在绿光照射下，它会自发转移质子从细胞质(CP)侧到膜的细胞外(EC)侧，因此可将太阳能转化为生物电。

图1

作者将bR与SiNx纳米孔纳米通道连接构建了一种生物纳米流体装置（图1c），装置由两个Ag/AgCl电极、bR贴片和直径约为25nm的单个SiNx纳米孔组成。通过对纳米孔表面电荷变化敏感的I-V曲线的离子电流整流响应变化（图1a）和原子力显微镜图像（图1b）验证了bR贴片在SiNx纳米孔上的成功跨膜组装。在用绿光(λ=532nm)照射时，纳米孔中的bR不断地将质子从PM的CP侧泵出到EC侧，从而在纳米通道中形成稳态H⁺流。如图1d所示，在突然的大瞬时电流响应后，正稳态bR光响应离子电流增量约13pA。

图2

为了探测单bR三聚体质子泵活性，作者制造了具有四种不同直径的单个SiNx纳米孔，并获得了相应的I-V曲线，用于计算每个纳米孔的直径（图2a-d）。如图2e-h所示，随着纳米孔孔径从60nm缩小到8nm，正离子电流的大小相应地从45pA下降到3.5pA。由单个bR三聚体在四个不同尺寸的纳米孔中产生的I-on的大小可以用来计算这四个纳米通道上覆盖的bR三聚体的理论数量分别为62、15、5和1。如图2j所示，四个测试设备上由单个bR三聚体产生的I-on分别计算为0.71、1.01、2.03和3.51pA。结果表明，在四个测试器件上由单个bR三聚体产生的计算光电流彼此不匹配，而且随着纳米通道尺寸的增加而减小。

图3

由于bR的CP侧和EC侧都带负电，bR贴片的静电沉积将导致bR的两个随机方向组装，除了观察到大多数光诱导离子器件的电流响应为正（H⁺从顺式流向反式）之外，也观察到负光离子电流响应（如图3a所示）。当EC侧面向SiNx纳米通道（图3b）的bR被绿光照射时，出现约14pA的负稳态电流响应，如图3c所示。器件的双向电流响应证实了bR的质子泵活性及其对纳米流体器件中电流的贡献。

图4

为了得到CP侧朝向纳米通道的定向bR单层，作者通过将bR与脂质重组成双层囊泡，然后将它们融合在设备表面上。图4a显示了在直径约为28nm的SiNx纳米孔上通过囊泡融合形成定向bR单层的示意图。预制bR囊泡附着在纳米孔上并阻塞了纳米孔（图4c，绿色曲线）。这时在绿光照射下，几乎没有净电流流过纳米孔（图4d）。孵育约1小时后，器件在绿光照射下发生向上波动的离子电流（图4e），这表明融合在SiNx纳米孔上的囊泡形成了定向bR单层。囊泡融合完成后，获得了10pA的恒定稳态正离子电流（图4f）。经过约2小时的连续测试，还观察到纳米孔支撑的bR单层的最终破裂，尤其是反映在一些波动（图4g）和光电流的最终消失（图4h）。

总之，本文通过将bR贴片与SiNx纳米孔集成，开发了以非常规的电阻脉冲纳米孔传感的策略，实现了对单个蛋白质的灵敏生物活性检测。这一方法可以进一步促进人造生物和混合纳米流体装置在生物传感和能量转换应用中的发展。