SmartMat:二茂铁-碳点交联纳米粒子用于肿瘤特异性光热放大的化学动力学治疗 - 课题组新闻

功能化的纳米材料因其独特的理化性能在肿瘤诊疗领域展现出巨大的应用潜力，提高治疗特异性同时降低副作用是该类材料实现临床转化的关键。碳点作为一类新型荧光纳米材料，具有可控的光学性能、良好的生物相容性、易于表面功能化修饰以及光激活的光热、光动力特性，具有作为诊疗制剂的天然优势。目前限制碳点在该领域应用的主要因素有：小尺寸导致材料较差的肿瘤富集，治疗缺乏特异性以及治疗效果有待提升。

有鉴于此，江南大学林恒伟教授课题组基于二茂铁二甲酸与氨基化碳点的简便交联开发了多功能诊疗制剂（Fc-CD NPs），可以实现增强的肿瘤累积及特异性放大的协同治疗。Fc-CD NPs展现出如下特点：（1）相比于游离碳点，Fc-CD NPs因其提升的材料尺寸而在肿瘤组织展现出更好的累积效果；（2）二茂铁分子不仅可作为交联中心，还能够提供肿瘤特异性的化学动力学治疗（CDT）效果,可选择性在肿瘤细胞内发挥良好的治疗效应；（3）二茂铁提供的CDT功能可以破坏热休克蛋白进而放大基于碳点本征的光热治疗（PTT）效果，而PTT效应反过来又可以提高CDT的效率，因此真正意义上发挥了两种治疗模式的协同优势；（4）碳点自身优异的光学性能（红光发射、光声响应）将成像功能集成在该体系中并避免了其他复杂的修饰、负载操作。

图1. Fc-CDNPs的制备及其在成像导引下肿瘤增强富集的协同治疗（光热及光动力）示意图。

相关研究成果以“Tumor-Specific and Photothermal-Augmented Chemodynamic Therapy by Ferrocene-Carbon Dot-Crosslinked Nanoparticles”为题发表在 SmartMat 上。通讯作者为江南大学林恒伟教授，第一作者为孙山副教授。

TEM显示游离的碳点（CDs）与Fc-CD NPs均为类球形的纳米颗粒（图2A和2B），且交联后材料的尺寸从2.35 nm增加到了11.6 nm。基于增强的穿透及滞留效应，Fc-CD NPs在肿瘤组织的富集明显提升并在后续动物实验层面得到了证实。Fc-CD NPs的水合粒径约为14.44 nm（图2C），同样满足了材料体内长循环的要求。从图2D中可以观察到，相较于单独碳点的红外光谱，Fc-CD NPs红外光谱中3200 cm−1附近的峰强度降低，可以归因于减少的氨基官能团，从侧面证明了基于酰胺键合反应的交联材料的成功制备。此外，从两类材料的吸收及特征发射光谱(图2E)中可以看出二茂铁的引入对于碳点的光学性能并没有明显影响，交联的步骤并未造成两种组分间明显的电荷/能量转移。图2F进一步展示了Fc-CD NPs灵敏的光声响应特性，随着材料浓度的提升光声信号强度也几乎线性增强。上述结果证明了Fc-CD NPs增大的材料尺寸、延展的吸收性能、红光发射及光声响应特性，凸显出材料在成像及肿瘤治疗领域的应用潜力。

图片图2：（A）CDs和（B）Fc-CD NPs的TEM图像（插图：尺寸分布直方图和高分辨TEM图像）；(C)Fc-CD NPs的水合粒径；(D)CDs和Fc-CD NPs的红外光谱；(E)CDs和Fc-CD NPs的UV-vis吸收光谱和最佳发射光谱；(F)不同浓度Fc-CD NPs的光声（PA）强度和相应图像。

随后，作者探究了Fc-CD NPs作为诊疗制剂的光热及化学动力学治疗特性。图3A和3B展示出在不同功率激光辐照下，Fc-CD NPs水溶液的温度升高情况。为了确保高温诱导的细胞凋亡，发挥材料光热治疗效应，0.06 W/cm2的辐照功率被选定为后续的实验功率。图3C和3D展示了在该功率辐照下不同浓度的Fc-CD NPs水溶液温度上升情况，随着溶液浓度的提升，其升温速率也逐步提升。此外，二茂铁分子可以在肿瘤弱酸及高双氧水浓度的微环境中发生芬顿反应，进而产生具有细胞毒性的羟基自由基（•OH），因而具有CDT的潜力。Fc-CD NPs产生•OH的性能利用荧光探针对苯二甲酸二钠（TA）进行了验证。如图3E所示，只有在Fc-CD NPs与双氧水共存的情况下，TA的荧光才能被有效激活，特异性的证明了•OH的产生。随着Fc-CD NPs浓度的提升，探针的荧光强度也不断增加（图3F）。随后，作者对Fc-CD NPs光热效应放大的•OH产生性能进行了研究。如图3G所示，激光辐照的样品展现出明显增强的TA荧光强度，且随着辐照时间的增加探针的强度不断增强，证明了光诱导的光热效应会促进材料产生•OH。

图片图3：（A）Fc-CD NPs (200μg/mL)在不同功率激光(660nm, 10 min,0.01到0.6 W/cm2)照射下的温度升高图像和（B）相应的热成像图片；（C）在强度为0.6W/cm2（660nm，10min）的激光照射下，不同浓度Fc-CD NPs 的温度升高图像和（D）相应的热成像图片；（E）TA+H2O2,Fc-CD NPs+H2O2和Fc-CD NPs+TA以及Fc-CD NPs+TA+H2O2的荧光光谱；（F）TA、H2O2与不同浓度Fc-CD NPs 孵育后的荧光光谱；（G）在有无激光辐照条件下，TA、 H2O2与不同浓度Fc-CD NPs (25到200μg/mL)孵育后的荧光光谱；（H）在不同激光辐照时间下，TA、H2O2与不同浓度Fc-CD NPs (25到200μg/mL)孵育后的荧光光谱。

得益于Fc-CD NPs优异的光学性能及潜在的诊疗应用价值，作者对其在细胞层面的成像、•OH产生、选择性癌细胞杀伤及协同治疗性能进行了探究。如图4A所示，针对不同的细胞，Fc-CD NPs均展现出良好的成像效果，明亮的红光显示出完整的细胞轮廓并且能够点亮细胞核仁，与商业细胞核染料联合使用，进一步验证了材料的共染性能。此外，Fc-CD NPs在细胞层面产生活性氧（即•OH）的性能利用细胞活性氧检测探针（DCFH-DA）进行了验证，经过Fc-CD NPs处理后的细胞其胞内活性氧含量明显提升（图4B和4C）。

图片图4：（A）五种细胞与Fc-CD NPs(50 µg/mL)孵育4h后，再用33258(5 µg/mL)处理30min的CLSM图像；（B）用DCFH-DA预处理并分别与PBS（空白）和Fc-CD NPs(50 µg/mL)孵育后，再用激光照射处理的4T1细胞的CLSM图像和（C）相应的定量结果；所有的比例尺均为20μm；**p<0.01。

图5A和5B分别展示了Fc-CD NPs与CDs对于正常细胞及癌细胞存活率的影响，当与材料孵育相同时间后，Fc-CD NPs仅对癌细胞展现出明显的杀伤效果而对正常细胞基本没有毒性，这主要归因于肿瘤微环境特异性激活的CDT效应。当细胞与Fc-CD NPs孵育后暴露于激光辐照的环境中，癌细胞的存活率进一步下降（图5C），验证了协同的PTT与CDT效应。为了验证Fc-CD NPs的CDT效应通过破坏热休克蛋白进而提升PTT效果的猜想，作者通过免疫荧光染色的手段对其进行了分析。如图5D所示，细胞经过光热处理后（与CDs孵育并进行激光辐照）热休克蛋白（HPS70）的表达明显提高，相比之下Fc-CD NPs共孵育且经过辐照的细胞并未展现出明显的绿色荧光，证明其HPS70的表达受到了抑制。上述实验结果证明了Fc-CD NPs良好的荧光成像，选择性癌细胞杀伤以及协同增强的治疗效果。

图片图5：（A）用不同浓度的Fc-CD NPs(25到200μg/mL)处理三种对应的正常细胞/癌细胞后的细胞存活率；（B）用不同浓度的CDs(25到200μg/mL) 处理三种对应的正常细胞/癌细胞后的细胞存活率；（C）不同浓度的Fc-CD NPs(25到200μg/mL)与4T1细胞孵育后，在有/无激光辐照下（660 nm, 0.6 W/cm2,10 min）的细胞存活率；（D）分别用PBS、H2O2、CDs(50 µg/mL)、Fc-CD NPs(50 µg/mL)和Fc-CD NPs(50 µg/mL)+H2O2处理4T1细胞，并用活死细胞染色试剂盒处理后的CLSM图像（比例尺：50μm）；（E）在有无激光辐照条件下，分别用PBS、CDs和Fc-CD NPs处理4T1细胞，随后用抗-HSP70抗体孵育后的免疫荧光染色图像（比例尺：100μm，插图为不同组别对应的平均荧光强度）；*p<0.05, **p<0.01。

随后，作者对Fc-CD NPs的活体成像行为进行了研究。在确认材料良好的血液相容性后（图6A和6B），首先对Fc-CD NPs 的光声成像效果进行了探究。如图6C和6D所示，尾静脉注射材料后约4 h光声信号强度达到了最高。离体组织的荧光成像结果也验证了肿瘤部位的荧光强度在4 h左右达到最高（图6E和6F），一方面验证了材料在肿瘤部位的有效富集，另一方面也明确了后续进行肿瘤治疗的最佳时间点。

图片图6：（A）用水（阳性对照（+））、PBS（阴性对照（−））和Fc-CD NPs在不同浓度(25到200μg/mL)处理的小鼠血液的照片和溶血率，以及(B)相应的吸收光谱；（C）荷瘤小鼠尾静脉注射Fc-CD NPs(100 μL, 2 mg/mL)后，不同时间点的PA信号强度和（D）图像；（E）在注射Fc-CD NPs(100μL，2mg/mL)后，小鼠在不同时间点肿瘤富集Fc-CDNPs的荧光强度（展示2只小鼠的数据）；（F）小鼠静脉注射Fc-CD NPs(100μL，2mg/mL)后，不同的时间点采集的主要器官（心脏、肝、脾、肺、肾）和肿瘤组织的荧光图像（展示2只小鼠的数据）。

最后，作者对Fc-CD NPs针对实体肿瘤的治疗效果进行了研究。首先，通过光热成像的手段对材料在肿瘤部位的富集效果进行了分析，如图7A和7B所示，尾静脉注射Fc-CD NPs小鼠的肿瘤部位在激光辐照条件下温度迅速提升，而单独注射CDs小鼠肿瘤部位的温度增长非常有限，证明了Fc-CD NPs在肿瘤部位增强的累积效果。图7C-7F验证了Fc-CD NPs基于协同CDT与PTT的治疗效果，在实现良好疗效的同时并未造成严重的系统毒性。

图片图7：（A）荷瘤小鼠在注射PBS、CDs(100 μL, 2 mg/mL) 和Fc-CD NPs(100 μL, 2 mg/mL)后，激光辐照条件下（660 nm, 0.6 W/cm2,10 min）的热成像图和（B）相应的温度变化曲线；（C）不同治疗组小鼠的肿瘤体积变化曲线和（D）第1、7和14天的照片；（E）不同治疗组肿瘤组织的H&E、Ki67和TUNEL染色图像；（F）不同治疗组小鼠体重的变化曲线；*p<0.05, **p<0.01。

本工作中，作者通过交联的手段开发了一种肿瘤特异性纳米诊疗平台(Fc-CD NPs)，表现出增强的肿瘤累积及光热/化学动力相互促进的协同治疗效果。Fc-CD NPs基于肿瘤微环境激活的CDT效应仅针对肿瘤细胞发挥特异性杀伤效果，CDT功效能够被碳点固有的光热性能加强。此外，Fc-CD NPs产生的活性氧能够破坏热休克蛋白进而放大材料的PTT性能。这项工作不仅提供了一种克服碳点小尺寸限制的简便策略，更提出了合理设计协同治疗方式以有效增强治疗效果并最小化副作用的新见解。