本周推荐的文章为03月22日黄进课题组每周的文献分享组会上，由焦元（2021级环境科学与工程专业本科生）分享的题为“Integrated ATAC-Seq and RNA-Seq Data Analysis to Reveal OsbZIP14 Function in Rice in Response to Heat Stress”的文章。该文章发表于International Journal of Molecular Sciences（中科院二区，IF=5.6，第一作者：Fuxiang Qiu，通讯作者：Huaqin He）。
文献内容简介
水稻是全球重要的粮食作物，其产量和质量对人类生存至关重要。全球气候变暖和频繁的高温天气对水稻生长构成了严重威胁。在水稻生长的各个阶段，高温都会产生严重负面影响，如导致幼苗死亡、发育迟缓、分蘖减少、小穗数量下降、花粉活力降低、授粉和受精受阻、粒重减轻、白垩现象增加以及适口性变差等。此外，高温还会损伤水稻的膜系统和光合作用，引起活性氧和植物激素失衡，以及碳水化合物代谢紊乱。品质生理劣化主要是由于热胁迫条件下籽粒灌浆速度加快、灌浆期缩短所致。参与储存蛋白生物合成的基因的转录调控对于热条件下的稻米品质至关重要。因此，了解植物感知胁迫信号并将其转导至细胞机制以启动植物耐热胁迫的适应性转录因子的分子机制，是确定培育耐热胁迫作物的关键基因和途径的必要先决条件。
为了进一步探索水稻对热应激的响应机制，本文作者运用了ATAC-seq和RNA-seq这两项组学技术进行了联合分析，鉴定出了三个关键的热响应转录因子基因：OsbZIP14、OsMYB2和OsHSF7。随后，他们验证了OsbZIP14在水稻热应激反应中的作用，并揭示了具体的作用机制。此外，研究还发现了一个与OsbZIP14相互作用的蛋白OsbZIP58，并探究了它们之间的相互作用机制。
ATAC-seq技术是一种研究染色质可及性的有效方法。它利用Tn5转座酶切割开放的染色质区域，然后连接高通量测序的接头，构建测序文库，并进行测序实验。通过对ATAC-seq数据的分析，可以绘制出染色质开放性图谱和表观基因组图谱，从而探究调控生物学过程的关键转录因子、信号通路和表型变化。
RNA-seq则是了解植物基因表达和筛选抗逆基因的有力工具。随着高通量测序技术的进步，多组学的结合已经成为揭示植物胁迫响应机制的必然趋势。本文作者通过ATAC-seq和RNA-seq的联合分析，快速有效地鉴定了植物中的关键胁迫反应转录因子，为未来相关研究提供了宝贵的参考。
ATAC-seq峰注释结果显示（图1），热胁迫下水稻启动子区的THS略有增加。大多数THS原本定位于一个基因，但热应激处理后，定位到一个基因的THSs比例下降，而定位两个或三个基因的THSs比例略有增加。这表明在热胁迫条件下，水稻启动子区的染色质可及性发生了变化，而这种变化可能导致相关基因的转录活性也随之改变。
图1 对照和热应激处理中的THS基因组分布
作者通过富集基序分析鉴定并筛选出了5个具有热响应转录因子的水稻基因（图2），其中有3个受热应激显著调控。为了验证ATAC-seq和RNA-seq分析结果的准确性，作者进行了RT-qPCR实验（图2）。实验验证了OsbZIP14、OsHSF7和OsMYB30三个基因的表达，结果显示这三个基因均显著下调，与之前RNA-seq的分析结果一致。
图2 富集基序分析与差异表达分析
为了明确OsbZIP14转录因子的功能，作者进行了OsbZIP14基因的亚细胞定位分析（图3）。他们使用两种载体分别转化水稻原生质体细胞和烟草表皮细胞，并观察到OsbZIP14蛋白位于细胞核。此外，作者还利用酵母双杂实验验证了OsbZIP14的转录活化作用。综合这些结果表明，OsbZIP14是一种具有转录激活功能的转录因子。
图3 亚细胞定位与酵母双杂实验
为了鉴定OsbZIP14的相互作用蛋白，作者通过建立酵母双杂交文库，转化含有OsbZIP14质粒的酵母细胞，并在三种缺陷培养基中筛选阳性克隆。最终成功鉴定出与OsbZIP14在热胁迫下相互作用的水稻蛋白。随后，作者使用HDOCK软件对蛋白质进行建模，并使用PLIP和PDBsum工具进行分析。发现OsbZIP58的ASN74和OsbZIP14的GLU274之间存在氢键（图4）。此外，在Q6ZLB0（OsbZIP58蛋白）中的31个接口氨基酸残基和Q0E476（OsbZIP14蛋白）中的28个接口氨基酸残基之间存在盐桥和氢键（图5）。这表明OsbZIP58与OsbZIP14之间存在相互作用。
图4 PLIP工具分析结果
图5 PDBsum工具分析结果
为了进一步确认OsbZIP14和OsbZIP58产物之间的直接相互作用，通过PCR克隆OsbZIP14和OsbZIP58的ORF，构建了三种载体质粒，并将相应质粒转移到水稻原生质体中，培养9小时后观察。处理后的样品中观察到黄光，对照组则没有黄光，这表明水稻中OsbZIP14和OsbZIP58蛋白之间存在直接相互作用。
图6 双分子荧光互补实验
为了验证OsbZIP14基因在水稻中的功能，作者将过表达OsbZIP14基因的植株和野生型植株在45°C下培养36小时。可以观察到两种植株的叶尖都表现出枯萎、变黄和老化（图7），但过表达植株的生长状况优于野生型植株。为了进一步研究热处理的影响，作者将培养36小时后的植株放置在室温下继续培养一个月（图8）。结果显示，过表达植株的生长情况仍然优于野生型植株，且过表达植株的存活率也高于野生型植株。以上结果表明，过表达OsbZIP14基因有助于水稻从热胁迫中恢复生长。
图7 热胁迫对OsbZIP14OE及WT植株生长的影响与存活率
为了进一步研究OsbZIP14在水稻中响应热胁迫的作用，作者将敲除OsbZIP14的植株与野生型植株在热胁迫下进行培养，结果表明，敲除OsbZIP14的植株更矮且分蘖更少，表明OsbZIP14促进了热胁迫下水稻植株的生长发育。同时作者检测到在敲除OsbZIP14的植株中OsbZIP58的相对表达水平相比野生型植株的相对表达水平更高，表明OsbZIP14对OsbZIP58的表达具有负调控作用。
图8 敲除OsbZIP14的植株与野生型植株在热胁迫下的生长对比与OsbZIP58相对表达水平
文献总结与分析
在本研究中，作者研究了热应激对水稻染色质可及性和基因表达的影响，旨在探究热应激反应过程中染色质结构的变化。通过RNA-seq与ATAC-seq联合分析，作者预测了三个转录因子基因，分别是OsbZIP14、OsMYB2和OsHSF7，并对OsbZIP14进行了详细的生理生化研究，揭示了其在响应热应激过程中扮演的重要调控角色。通过全面的生物信息学分析，作者发现OsbZIP14含有一个碱性亮氨酸拉链结构域，主要作为具有转录激活功能的核心转录因子发挥作用。此外，作者通过在幼苗和灌浆阶段进行OsbZIP14基因的过表达和敲除实验，验证了该基因对水稻在热胁迫条件下生长的影响。最终，通过结合计算和实验方法，验证了OsbZIP14蛋白和OsbZIP58蛋白之间的相互作用，后者作为水稻种子贮藏蛋白（SSP）积累的关键调控基因。这些发现为水稻的遗传改良提供了有益的候选基因，并深入揭示了水稻在耐受热胁迫方面的机制。
于本课题组启示
通过对本文的学习，我们了解到，在植物胁迫响应中，染色质状态和转录因子扮演着关键角色。这为我们深入探究植物在胁迫条件下基因表达调控的机制提供了重要线索。进一步研究转录因子之间的相互作用可能有助于揭示更多的调控机制。而ATAC-seq与RNA-seq的联合分析为我们快速、高效地鉴定植物胁迫反应转录因子提供了一种有效思路。此外，本文逻辑严密，条理清晰。在此过程中所使用的数据分析方法和工具也值得我们学习和效仿。
