本周推荐的文章为2月26日黄进课题组每周的文献分享组会上，由周映旭（2023级生物技术与工程专业硕士研究生）分享的题为“GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1 transcriptional cascade”的文章。该文章发表于Plant Biotechnology Journal（中科院1区，IF=13.8，第一作者：Xi Wei，通讯作者：Xiaoyang Ge）。
文献内容简介
目前，由于采矿、电镀、含镉废水排放及滥用肥料、农药等生产活动，导致我国土壤重金属污染问题日益突出。棉花作为一种重要的非食用性经济作物，与粮食作物（小麦、水稻和玉米）、油料作物（花生和大豆）和蔬菜（豆类、黄瓜和番茄）相比，在修复土壤镉污染方面具有天然优势，因为利用棉花进行土壤污染修复时无需担心镉进入食物链的风险。因此，探究棉花响应镉胁迫的精细调控机制至关重要。
首先作者通过利用50 μM CdCl2广泛筛选，鉴定出一个对镉敏感的棉花T-DNA插入突变体ghrcd1，并通过构建敲除突变体进行PI染色和表型观察验证了GhRCD1能够提高棉花植株对Cd的耐受性（Fig. 1）。
Fig.1
随后作者通过酵母双杂交实验筛选出与RCD1互作的蛋白bHLH12，并通过双分子荧光互补、GST-pull down、免疫荧光共定位对二者之间的互作进行了确认。随后，作者将bHLH12分为三个部分分别与RCD1进行酵母双杂交，发现RCD1与bHLH12结合的关键部分是bHLH12的前202个氨基酸（Fig. 2）。
Fig.2
为探究bHLH12是否参与到棉花镉耐受调控过程。作者构建bHLH12过表达以及突变体植株在镉处理下进行PI染色和表型观察，实验结果表明bHLH12能够降低棉花对镉的耐受性（Fig. 3）。
Fig.3
为找出bHLH12转录因子下游调控的靶基因，作者通过DAP-Seq分析发现bHLH12富集在转录因子MYB44的启动子区域，随后作者利用MYB44启动子突变序列，并通过酵母单杂交、EMSA实验验证了bHLH12转录因子与MYB44启动子区域的特异性地结合。并且后续通过荧光素酶报告实验发现bHLH12与MYB44启动子区域结合后抑制MYB44的表达，而加入RCD1后抑制效果明显减弱。因此作者推测RCD1与bHLH12之间竞争性结合从而降低bHLH12与MYB44启动子的结合效率从而间接地增强了MYB44的转录活性。（Fig. 4）
Fig.4
随后作者构建了MYB44过表达及突变体植株，PI染色以及表型观察结果表明MYB44也参与棉花植株对镉耐受的调控过程（Fig. 5）。
Fig.5
由于MYB44本身也是转录因子，所以作者继续通过DAP-seq寻找MYB44的下游靶基因。在筛选出的众多基因中，由于已有报道表明HMA1p参与重金属离子向液泡转运的过程，所以作者将该基因作为后续研究对象。因此作者构建了HMA1p启动子的突变序列通过酵母单杂和EMSA验证了MYB44与HMA1p启动子区域的特异性结合。并通过构建hma1p突变体植株实验验证HMA1p参与棉花对镉耐受的调控过程。（Fig. 6）
Fig.6
已有研究表明MYBs蛋白家族通常与ABA受体蛋白家族PYLs结合，因此作者开展了酵母双杂筛选实验。筛选结果表明MYB44与PYL8互作，且该互作结果也通过免疫荧光共定位和GST-pull down实验得以验证。随后作者通过构建PYL8过表达植株对PYL8进行功能验证。实验结果表明PYL8与能提高植物体内ABA含量并正向调控棉花镉耐受能力。（Fig. 7）
Fig.7
文献总结
综上所述作者发现RCD1能通过竞争性与bHLH12结合从而间接增强MYB44表达，而MYB44能够作为转录因子调控下游HMA1p的表达从而促进Cd2+向液泡内转运，降低Cd2+对细胞的毒害，另外MYB44还可直接与PYL8互作影响ABA信号通路从而调控棉花对镉的耐受性。
于本课题组启示
一、本文中所采用的PI染色观察植株活细胞数量和形态从而判断植物受镉胁迫程度的方法与传统的宏观表型观察法相比更加直观，并且也从微观角度提供了表型证据，使结果更为全面，可信度也更高。
二、整体而言，文中数据规范、美观，便于读者理解。因此，我们在平时采集数据、整理数据的过程中，应提前知晓标准和规范并严格执行，这样才能保证数据的质量。
三、在本文中作者逻辑严谨层层递进，以RCD1为起点以镉胁迫为主线，在后续研究中每找到一个下游基因都会重新考虑其与RCD1以及镉耐受之间的关系，目标明确，适当拓展而不发散。通过对文的学习，我们可以学习作者如何抓主线、紧扣关键问题的叙事、写作技巧。而且，本文作者在最后的总结图示中，色彩、设计安排合理，整体逻辑清晰，对于读者理解文章的整体思路非常友好。因此，作者在总结图的绘制技巧、逻辑安排等方面也非常值得我们学习。
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