人十二指肠粘膜下腺含有一个明确的干/祖细胞亚群，具有肝脏特异性再生潜能

【据《Journal of Hepatology》2023年1月报道】题：人十二指肠粘膜下腺含有一个明确的干/祖细胞亚群，具有肝脏特异性再生潜能。（作者：Cardinale等）

原位肝移植和细胞治疗是目前治疗急性肝衰竭和终末期慢性肝病的有效方法，但由于受到器官供体严重短缺、重编程细胞表观遗传不稳定的问题，限制了其临床应用。成体器官内的明确细胞群具有分化或转化为同一胚层内的多个成熟细胞的潜能。因此，新细胞来源的个体化应合理地基于靶器官的胚胎学起源。人体最大的实质器官肝脏在原肠胚阶段由内胚层发育而来，其萌芽部位相当于成人十二指肠近端部。十二指肠的近端部分在粘膜下层内含有明显的上皮隔室，由粘膜下腺（submucosal glands，SGs）表示，也称为Brunner腺。研究人员在人十二指肠黏膜下腺（duodenal submucosal glands，dSGs）中发现了一群具有肝脏特异性再生潜能的干/祖细胞亚群，为肝脏再生提供了一个新的细胞来源。

研究人员首先分析了SGs在十二指肠内的分布。发现其主要分布在十二指肠的上部和降部，内镜活检可在此成功取材。通过免疫组化发现dSGs含有不同表型的细胞亚群，其中包含一个以干/祖细胞标记物(如Sox9、EpCAM和Tra-1-60)阳性为特征的细胞亚群。接下来研究人员将dSGs的表型与粘膜上皮细胞的表型进行比较，发现dSGs具有不同表型:(i)首先是表达细胞角蛋白(KRT7⁺)和粘蛋白(Muc6⁺)谱；(ii)其次表达tra1 -60/ tra1 -81和与多能干细胞相关的转录因子OCT4a；(iii)dSGs的增殖比例较低。之后对Sox9⁺和Tra-1-60⁺细胞进行双重免疫荧光发现这两群细胞都高表达EpCAM和KRT 7。

为了进一步表征分离的细胞亚部分，研究人员通过RNA测序进行了整个转录组分析。发现分离的dSGs (n = 3)与完整的十二指肠(n = 3)明显不同;相对于完整的十二指肠， dSGs中有2690个基因显著上调，2038个基因显著下调(调整后p <0.05)。基质细胞标记物在完整的十二指肠中富集，而内胚层祖细胞标记物在dSGs中富集。接下来，研究人员将分离细胞的基因表达谱与成人肝细胞(AHEPs)、胆道树干细胞(BTSCs)、十二指肠隐窝类器官(IO)、定型内胚层(DE)和人类胚胎干细胞(hESCs)的基因表达谱进行了比较。层次聚类分析和PCA显示，分离的dSGs与BTSCs、IO、DE和AHEPs的分子组成不同。在dSGs中显示出GATA4的富集以及SOX9、PDX1、MAFA、HNF4A和KLF4的强劲表达。

研究人员将EpCAM⁺细胞从dSGs中分选出来进行体外扩增和类器官培养。EpCAM⁺ dSGs在体外扩增培养14天，免疫荧光发现其细胞集落表达关键的祖细胞标记物（Sox9 、Oct4A等）；在培养3-5后可见有类器官形成。通过qPCR比较2D培养和类器官之间相关干细胞基因的表达，显示多能性基因没有差异，内胚层祖基因整体增加。类器官的断面研究也证实了内胚层祖标记物(共)的表达，包括Lgr5、Sox9、Sox17、Pdx1、Hnf4a和EpCAM。

接下来研究人员为了评估dSGs的体外分化能力，使用肝系分化培养基(HM)对其进行诱导，在HM中培养14天后，dSGs中与成熟肝细胞功能相关的基因上调，在无监督层次聚类分析中，其水平接近肝组织和HepG2。在HM中培养14天后，通过检测白蛋白基因表达、氨消除、细胞色素活性、糖原储存、LDL摄取和吲哚菁绿(ICG)摄取和释放证明dSGs获得了功能性肝细胞特性。下面研究人员将评估dSGs移植到小鼠体内的分化能力。为了模拟潜在的临床情况，研究人员将人dSGs通过脾脏移植注射到急性(APAP中毒)和慢性(HFD)肝损伤的SCID小鼠模型中。发现在注射了人dSGs的APAP小鼠与APAP小鼠相比肝细胞坏死在组织学水平和血清白蛋白水平上没有差异。表明，在急性肝损伤的短时间内，dSGs表现出移植入肝脏的能力，但没有获得肝细胞功能。与未接受人dSGs的HFD小鼠相比，接受人dSGs的HFD小鼠显示出较低的血清ALT和改善的血脂水平。经组织学检查，脂肪变性也显著降低。qPCR在注射人dSGs的HFD小鼠中检测到人白蛋白基因表达，同时通过双免疫荧光原位检测白蛋白、微管标记物胆盐出口泵(BSEP)、氨基甲酸酯合成酶1 (Cps1)和CYP3A4，确认获得成熟肝细胞性状。对脂质体生和内质网应激标记的评估表明，注射了人dSGs的脂肪肝小鼠与HFD小鼠相比，受脂毒性的影响较小。 表明dSG细胞在体内可分化为成熟的肝细胞，进而对慢性肝损伤小鼠起到治疗作用。

综上所述，该研究发现在成人十二指肠粘膜下腺体中包含了一群以Sox9 、EpCAM 、Tra1-60阳性为特征的内胚层祖细胞（sSG cells) 该类细胞在体外培养过程中呈克隆生长、具有形成类器官和获得功能性肝细胞性状的能力。在体内脂肪肝的实验模型中，人十二指肠粘膜下腺细胞能够通过支持肝脏的再增殖和再生来拯救宿主免受肝损伤。dSGCs为肝脏再生提供了一个新的细胞来源。

（再生医学研究所 路梦琦 何志颖 报道）