近日，钟鸿英教授团队在磷酸化蛋白的光聚合串联凝胶电泳技术研究中取得了重要进展，相关研究成果“Electrophoresis of Phosphoproteins on A Tandem Polymerized Gel”以正封面形式发表于分析化学领域顶级期刊Analytical Chemistry（2022, 94, 7466-7474）。博士生张文洋、硕士生冷挟斌和博士生亓英华为并列第一作者，钟鸿英教授为通讯作者，华中师范大学和广西大学为通讯单位。

蛋白质翻译后磷酸化修饰（Phosphorylation）是指在磷酸化激酶催化下，特定氨基酸残基比如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸与磷酸基团共价结合的过程。蛋白质磷酸化是一种广泛存在的翻译后修饰，细胞中许多蛋白质都可发生磷酸化修饰，对细胞多层次交叉信号转导的空分辨调控起着重要作用。在细胞中，特定激酶可以选择性催化磷酸化修饰，少数多功能酶还可以同时作用于不同氨基酸残基。在不同时间和不同氨基酸位点发生磷酸化修饰后，产生具有不同结构的磷酸化蛋白异构体（Phospho-Isoforms），这些蛋白质异构体往往具有非常相似的质量。常规十二烷基磺酸聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS PAGE）是一种在碱性条件下按照质量进行蛋白质分离的技术，其分辨率不足以区分磷酸化修饰蛋白异构体。比如一个分子量为10 KDa的蛋白质发生一个磷酸化修饰后，其质量只增加了0.8%，磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白可能同时出现在一个SDS PAGE条带，因此低丰度磷酸化修饰蛋白往往被非磷酸化蛋白掩盖。

钟鸿英教授研究团队建立了一种用于分离磷酸化蛋白的新型光聚合串联凝胶电泳技术，这种技术在酸性条件下按照电荷-质量比（z/m）进行蛋白质分离。携带正电荷的质子化蛋白首先于低电压下在浓缩胶(stacking gel) 被富集，升高电压后进入Zr⁴⁺固定化凝胶层（Zr⁴⁺ immobilized gel），蛋白质因携带的磷酸基团与Zr⁴⁺离子配位而改变泳动速度，最后在ATU凝胶（Triton X-100-acetic acid-urea gel）上进一步按照电荷-质量比进行分离。在酸性条件下，纳米TiO₂用于在紫外光照下引发丙烯酰胺聚合反应。

影响蛋白质正电荷数量的主要因素包括：（1）碱性基团。赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸残基在酸性条件下质子化，使得蛋白质携带正电荷；（2）磷酸化修饰。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基发生磷酸化修饰引入负电荷，减少蛋白质携带的正电荷；（3）甲基化和乙酰化修饰。赖氨酸和精氨酸残基发生甲基化或乙酰化修饰，减少蛋白质携带的正电荷。可见，相对于常规SDS PAGE技术，按照电荷-质量比（z/m）进行蛋白质分离的凝胶电泳技术，能够反映更多结构特征，因此具有更高分辨能力。钟鸿英教授研究团队建立的磷酸化蛋白光聚合串联凝胶电泳技术，为认识磷酸化修饰及其相关的复杂生物学过程提供了一种新工具，具有重要科学价值和广泛应用前景。