食管癌（EC），包括食管腺癌（EAC）和食管鳞状细胞癌（ESCC），是最常见的癌症之一，全球每年导致 45 万人死亡。目前，手术是治疗局部肿瘤的主要手段。同时，对于那些处于晚期且总体状况不佳的患者，已经失去手术机会，化疗成为主要的治疗选择。但是食管癌化疗药物的开发仍处于起步阶段。通常，在传统的药物开发中，二维单层细胞被用于体外试验，其在形态和功能上与天然状态的细胞有很大差异。由于药物开发平台的局限性，现有的化疗药物显示出低响应率和不可忽视的差异。因此，构建一个能重现体内生理和病理生理状态的基于细胞水平的平台对于化疗药物的开发具有重要价值。
近年来，为了解决这个问题，科学家们开始探索使用3D细胞培养支架来模拟体内的细胞环境。3D细胞培养支架是一种提供细胞生长和扩张所需的三维结构的材料。这种支架可以模拟细胞在人体内的生长和发育过程，并提供更接近真实情况的研究环境，有助于更准确地评估药物对细胞的影响和药物的潜在毒性等。相关研究还致力于改进支架材料，优化结构设计，以增强其性能和应用效果。使用三维细胞培养技术生成的肿瘤球聚体已成为模拟实体瘤特征的替代工具。与单层细胞相比，具有3D结构的肿瘤球聚体能够更精确地概括肿瘤起始和进展中的重要过程。
关键词：食管癌、微流控、反蛋白石支架、肿瘤芯片、化疗药物筛查
图文导读
利用单乳液微流控装置制备了具有反蛋白石结构的三维支架，将食管癌细胞装入微流控芯片中，构建食管癌药物筛选平台。
具有反蛋白石孔结构的PEGDA水凝胶支架是使用液滴模板方法生成的（如图一）。为了使水凝胶支架具有足够的机械强度和透明度，在随后的实验中使用了60%的PEGDA溶液。将PEGDA前驱体溶液（作为水相）和甲基硅油（作为油相）注入毛细管微流控装置中，并在剪切力的作用下产生乳液液滴。形成的油滴是单分散的，通过改变水相和油相的流速，可以很好地调整其大小。由于尺寸均匀，油滴可以在PEGDA前驱体溶液中自组装成多层结构。利用这一特性，我们通过在紫外线辐射下交联PEGDA前体溶液并洗去油滴，获得了具有反蛋白石结构的PEGDA支架。正如在SEM下观察到的那样，PEGDA支架包含整齐排列和相互连接的孔隙，这对于足够的物质交换是必要的。此外，无显著的细胞毒性
为了拓宽其应用潜力，将PEGDA支架组装成微流体芯片，以实现高通量试剂筛选。在这项研究中，微流控芯片被用作筛选平台，这要归功于它能够为细胞球的实时培养观察提供合适的三维环境，该芯片由四个细胞培养室组成，每个细胞培养室都连接到入口和出口，每个细胞培养室都有一个子入口和出口，用于检测细胞培养液中的相关因子。这被用作于药物筛选的微流控平台建模的基础。
由于生成的细胞球体表现出与体内相似的生长模式，因此带有PEGDA支架的微流体芯片有望成为抗癌药物筛选的理想体外模型。为了证实我们的猜想，我们检查了细胞球体对化疗剂的敏感性。选取食管癌治疗中常用的一系列化疗药物（DOX、PTG、5-FU、DDP）治疗KYSE-70细胞球体，并将2D培养中生长的KYSE-70细胞作为对照。作为MTT测定的结果（图5c-f），随着化疗药物浓度的增加，所有组的细胞增殖都减弱了。值得注意的是，细胞球体在低浓度（0.001μM）药物刺激下表现出更高的细胞增殖抑制率，表明它们对药物的敏感性增强。此外，我们还进行了活细胞/死细胞染色，以探索细胞培养模式对化疗药物细胞毒性作用的调节。结果表明，在相同条件下，细胞球状体组的KYSE-70细胞死亡率明显高于2D培养组。从上述结果可以得出结论，细胞球状体对化疗药物的杀伤作用具有很高的敏感性，并且它们的药物敏感性更能反映体内情况。
值得一提的是，细胞球体对化疗剂的敏感性高于 2D 培养细胞，这在 DDP 处理组中尤为明显。如定量分析所示，细胞球状体组的相对增殖抑制率上升了四倍，相对凋亡率上升了两倍。基于细胞球体的体外模型对化疗药物的高敏感性使他们在筛选有效药物和减少药物副作用方面具有独特的优势。从上述结果推断，在基于PEGDA的逆蛋白石结构支架中形成的KYSE-70细胞球体在体内能更好地模拟食管肿瘤的生长，表明其在化疗药物开发方面具有优势。为进一步评价其功能，在成功生成KYSE-70细胞球聚体后，通过流入通道注入DOX、PTX、5-FU和DDP的药剂溶液，检测流出液中代表性肿瘤标志物的水平。如图6e-g所示，随着化疗药物的治疗，CEA、CYFRA21-1和SCCAg的水平明显下降。在四种化疗药物中，DDP对肿瘤细胞的杀伤作用最强。通过结合微流控芯片和3D水凝胶支架，我们可以在短时间内对多种化疗药物进行高通量检测，筛选出具有治疗作用的药物，有助于加速药物开发进程，为药物的发现和开发提供分子和形态学基础。研究表明，细胞球状体集成的微流体芯片可以在体外保持食管肿瘤的病理特征，并对化疗药物的治疗表现出准确的反应，因此在药物评价和筛选方面具有广阔的潜力。
4. 总结与未来展望（Conclusion&Future perspectives）
近年来，用于3D细胞培养的支架材料不断增加，包括合成高分子材料和各种天然生物材料。这些材料表现出更好的生物相容性和可调节性，并在药物筛选中得到了广泛的应用。然而，长期培养过程中的稳定性和生物降解性仍需优化。
在这项研究中，我们设计了一种微流控芯片，用于筛选食管癌的化疗药物。在实际使用中，它可以保证四种药物在微尺度上以3D模式同时筛选。这些独特的特点凸显了食管肿瘤球状体作为一种先进的药物筛选平台的潜力，在化疗药物开发领域具有重要的应用价值。我们还希望进一步的研究能够完善这种芯片的概念，改进其设计和性能，使其在更多疾病的药物筛选中发挥作用，同时可以更好的与个性化医疗的原则紧密结合。
本项目由国家重点研发计划（2022YFE132800）、河南省创新科技团队项目（CXTD2017071）、河南省重点研发项目（221111310600）和河南省高等学校基础研究发展计划专项基金（22ZX005）提供经费支持。