湖南大学刘斌教授和湖南中医药大学王炜教授：利用蟾酥有效活性成分华蟾毒精（CS-1）诱导TNBC细胞焦亡的功能以及普鲁士蓝纳米颗粒高效负载和光热的特点，用于联合增强免疫原性细胞死亡，有效抑制TNBC复发和转移，为癌症治疗提供新思路。

     

      TNBC因其独特的生物学行为、临床病理特征和不良预后而成为威胁女性健康的主要因素。尽管手术是减轻TNBC的主要治疗方法，但手术后仍存在高潜在风险，可能出现肿瘤复发和转移。最近，免疫疗法在TNBC的治疗中取得了一定进展，可有效抑制肿瘤的复发和转移。然而，TNBC通常表现出较低的免疫原性，这意味着免疫系统不容易识别和攻击肿瘤细胞。免疫原性细胞死亡（ICD）作为免疫治疗的关键步骤，在TNBC免疫治疗中具有重要意义。因此，如何获得高效ICD的策略用于TNBC免疫治疗仍然是一个重大挑战。

  焦亡，是一种程序性细胞死亡，取决于gasdermin家族（GSDMs）的激活，进一步诱导细胞膜成孔和GSDMs N端片段释放，导致细胞肿胀破裂，导致细胞死亡。更重要的是，由于细胞膜破裂和细胞内容物的释放，细胞毒性淋巴细胞被激活杀死肿瘤细胞，这与抗肿瘤免疫应答密切相关，是一种非常有前途的肿瘤治疗方法。作为一种重要的焦亡途径，激活半胱天冬酶-3/gasdermin E（CASP3/GSDME）可以进一步触发宿主免疫系统的激活，刺激“冷”肿瘤微环境成为免疫原性“热”肿瘤微环境，并对乳腺癌、黑色素瘤、胃癌等多种肿瘤有显著的抑制作用。人们已经做了很多努力来利用焦亡途径作为癌症治疗的靶标，如许多化疗药物（阿霉素和顺铂等）已被证明有诱导焦亡的潜力。然而，与药物相关的副作用和耐药性仍然是主要的问题。因此，新型焦亡激活剂的发现对TNBC免疫治疗有很好的贡献。

  华蟾毒精（CS-1），是一种从蟾蜍中提取的蟾酥有效成分，近年来因其广泛的药理作用，包括抗炎、镇痛和通过细胞周期阻滞和抑制细胞迁移来抗肿瘤引起了人们对癌症治疗的广泛关注。在本研究中，湖南大学刘斌团队发现了CS-1抑制TNBC细胞具有浓度依赖性，并研究了这种抗肿瘤作用可来自于CASP3/ GSDME焦亡途径的激活。因此，CS-1作为焦亡促进剂通过靶向GSDME是免疫治疗TNBC的良好策略。然而，与其他脂溶性药物类似，水溶性差和非选择性仍然是CS-1应用于TNBC治疗的主要障碍。因此，构建递送载体是解决CS-1在递送中稳定性、靶向性以及控制释放的关键之一。

  为了改善CS-1的肿瘤靶向富集，作者通过两步法构建了CS-1@PB[HM] NPs。首先，通过普鲁士蓝纳米颗粒的高效负载特性加载了CS-1合成了CS-1@PB NPs。随后，用红细胞膜和TNBC细胞膜融合构建的杂化膜（HM）进行表面涂层，以构建具有免疫逃逸和肿瘤归巢能力的仿生普鲁士蓝纳米复合物（CS-1@PB[HM] NPs）。体外实验表明，CS-1诱导的焦亡联合PB NPs的光热治疗产生了高水平的ICD，最终促进了树突状细胞（DCs）成熟。体内抗肿瘤实验进一步表明，这一策略不仅有效抑制了MDA-MB-231细胞和4T1细胞荷瘤小鼠模型的原发肿瘤生长，还在4T1荷瘤小鼠模型中有效抑制了远处肿瘤生长，其机制包括促进DCs成熟、细胞毒性T淋巴细胞浸润和抑制调节性T细胞水平。

     

图 1. CS-1 诱导 MDA-MB-231 细胞发生热休克。 (A）CS-1 浓度对 MDA-MB-231 细胞活力的影响。 (B) CS-1 处理 MDA-MB-231 细胞 8 小时后的形态学图像；红色箭头表示凋亡细胞。 (C) CS-1 处理 MDA-MB-231 细胞的 LDH 检测。 (D) CS-1 处理 24 小时后 MDA-MB-231 细胞中 GSDME 和 caspase-3 的 Western 印迹。 (E) CS-1 处理后 MDA-MB-231 细胞中 ROS 的流式细胞术检测。 Rosup（上图）作为阳性对照。 (F) CS-1 处理 MDA-MB-231 细胞 8 小时后的细胞内 ATP 检测。 (G）预处理 MDA-MB-231 细胞的细胞内 Ca2+ 图像。 (H）用 CS-1 处理 MDA-MB-231 细胞时线粒体膜电位的荧光图像。 (I）CS-1 诱导细胞热解的机制示意图。 (关于本图中颜色的解释，读者可参阅本文的网络版）。

图 2. CS-1@PB[HM] NPs 的合成与表征。 (A-C）PB NPs、CS-1@PB NPs 和 CS-1@PB[HM] NPs 的 TEM 图像和 DLS 分析。 (D）PB NPs、CS-1@PB NPs 和 CS-1@PB[HM] NPs 的颗粒 zeta 电位。 (E-F）CS-1@PB NPs 和 CS-1@PB[HM] NPs 的 EDS 光谱。 (G）PB NPs、CS-1@PB NPs 和 CS-1@PB[HM] NPs 的紫外可见光谱。 (H-I）不同样品（0.2 mg/mL）在 808 nm 激光照射（1 W/cm2）下的红外热图像和温度曲线。 (J) CS-1@PB[HM] NPs 水分散液（1 mL，0.05 mg/mL）在激光（1 W/cm2）照射和关闭时的光热曲线。 根据光热曲线得出 CS-1@PB[HM] NPs 的线性冷却时间和 Ln (θ)。 (K）0.2 mg/mL CS-1@PB[HM] NPs 在 808 nm 激光照射（1 W/cm2）下的光稳定性研究。 (L) 激光照射下 CS-1@PB[HM] NPs 的 CS-1 释放行为。

图 3. CS-1@PB[HM] NPs 的生物相容性和免疫逃逸能力。 (A）不同浓度的 CS-1@PB NPs 和 CS-1@PB[HM] NPs 对 RBC 的溶血定量分析和物理照片。 (B）不同纳米材料处理 RBC 6 小时后的显微图像。 (C）凝血酶、CS-1@PB NPs 和 CS-1@PB[HM] NPs 的血小板聚集试验。 (D）PB[HM] NPs（不加载 CS-1）对 SMC 细胞和 NIH-3T3 细胞的细胞毒性。 (E-F）用 PBRho 和 PBRho[HM] 培养 RAW264.7 细胞 4 小时后的 CLSM 图像和荧光定量。

图 4. CS-1@PB[HM] NPs 的归巢效应和穿透能力检测。 (A) MDA-MB-231 细胞和 BGC-823 细胞经不同处理培养 6 h 后的 CLSM 图像。 (B) PBRho 和 PBRho[HM] NPs 穿透三维肿瘤球的 CLSM 图像。 (C) PB[HM] NPs 在三维肿瘤球中不同 Z 轴的荧光强度定量分析。 (D) PBCe6 和 PBCe6[HM] NPs 在肿瘤部位的荧光图像。 (E-F）尾静脉注射 PBCe6 和 PBCe6[HM] NPs 24 小时后在离体器官中的荧光强度和定量分析。

图 5. CS-1@PB[HM] NPs 的裂解行为。 (A) MTT 试验。 (B-C）不同处理的 MDA-MB-231 细胞的活/死染色和流式分析： PBS、PBS + L、PB[HM]、PB[HM]+L、CS-1@PB[HM]和 CS-1@PB[HM]+ L。 (D) 用 PBS、PBS + L、PB[HM]、PB[HM]+L、CS-1@PB[HM]和 CS-1@PB[HM]+L（30 μg/mL PB NPs）处理后细胞的代表性形态。 红色箭头指向猝灭细胞。 (E-G）激光照射下细胞中 ROS、细胞内 Ca2+ 和 JC-1 的荧光图像。 (H）不同处理方法下 MDA-MB-231 细胞胞内 ATP 的检测。 (I）PBS、PB[HM]+L、CS-1@PB[HM]和 CS-1@PB[HM]+L 处理 24 h 细胞的 LDH 水平。 808 nm 激光功率为 1 W/cm2，持续 5 分钟。 (J) Western 印迹分析不同处理 24 小时的细胞中的 caspase-3 和 GSDME-N。 (关于本图中颜色的解释，读者可参阅本文的网络版）。

图 6. CS-1@PB[HM] NPs 诱导免疫原性细胞死亡。 (A)CS-1@PB[HM] NPs 激活细胞凋亡机制示意图。 (B-C) 经 PBS（i）、CS-1（ii）、PB[HM]+L（iii）、CS-1@PB[HM]（iv）和 CS-1@PB[HM]+L （v）处理后，MDA-MB-231 细胞中 HMGB1 和 CRT 的 CLSM 图像。 (D）诱导 BMDCs 成熟的实验过程。 (E）用不同配方处理的 BMDCs 的代表性明视野显微镜图像。 (F-G）流式细胞术检测 CD11c+ BMDCs 上 costimulatory 分子 CD80 和 CD86 的表达。 (H-I）用 CS-1（5 μM）、PB[HM]+L、CS-1@PB[HM]和 CS-1@PB[HM]+L（30 μg/mL）处理后，BMDCs 释放的炎症因子 IL-12/p40 和 TNF-α 的浓度检测。

图 7. CS-1@PB[HM] NPs 对 MDA-MB-231 肿瘤模型小鼠的抗肿瘤作用。 (A) 体内治疗方案。 (B) 治疗期间体重的变化。 (C）小鼠肿瘤生长曲线（n = 4）。 (D）不同治疗后的肿瘤重量。 (E）不同治疗后小鼠肿瘤的照片。 (F) TNBC 肿瘤切片的 H&E 和 TUNEL 染色。

图 8. CS-1@PB[HM] NPs 对 4T1 肿瘤模型的抗肿瘤作用。 (A) 体内治疗方案。 (B) 治疗期间体重的变化。 不同治疗组（n = 5）小鼠原发肿瘤（C）和远处肿瘤（H）的生长曲线。 激光治疗组（L）用波长为 808 nm、功率为 1 W/cm2 的激光照射 5 分钟。 原发肿瘤（D）和远处肿瘤（I）的物理视图，第 20 天时，原发肿瘤和（J）远处肿瘤被切除。 (E)原发肿瘤和(J)相应的远处肿瘤在第 20 天时的重量。 原发肿瘤（F）和远处肿瘤（K）的生长曲线。 原发性（G）和远处（L）肿瘤切片的 H&E 染色。

图 9. 基于 CS-1@PB[HM] NPs 的化疗/光热疗法的抗肿瘤免疫效应。 (A) 局部肿瘤组织中 HMGB1 和 CRT 的荧光图像和半定量分析。 (B-G）治疗结束时，TDLNs 和原发肿瘤中成熟 DCs（CD45+CD11c+CD80+CD86+）、T 细胞（CD45+CD3+CD8+）和 Tregs（CD45+CD3+CD4+Foxp3+）的代表性流式细胞术分析和相应的定量百分比。

综上所述，这项工作为CS-1靶向TNBC治疗提供了新的策略，新构建的仿生普鲁士蓝纳米复合物（CS-1@PB[HM] NPs）可作为一种有效、安全、诱导增强型ICD的肿瘤治疗手段。论文第一作者为湖南大学生命医学交叉研究院的龙樱博士、生物学院的范家龙博士和周纳多硕士，湖南大学生物学院的刘斌教授和湖南中医药大学药学院王炜教授为该文章的共同通讯作者。

 课题组简介

湖南大学生物学院刘斌教授：湖南大学教授，博士生导师，中国民族医药协会委员，湖南中医药大学中药民族药创新发展实验室学术委员会委员。1994年毕业于湖南师范大学生物系，2001年于中南大学肿瘤研究所获硕士学位，研究方向为鼻咽癌发病分子机制；2002年至2007年在湖南大学攻读博士学位，研究方向为纳米荧光探针与肿瘤生化分析，2007年9月赴美国Texas Tech University医学院开展博士后研究，研究内容为肾类疾病分子机制。目前研究方向主要集中在药用植物活性成分群的靶向筛选、抗肿瘤、心血管疾病的天然药物靶向递送和抗感染复合纳米材料研究。先后主持和参与各类科研项目20余项，以第一和通讯作者身份在ACS Nano, Biomaterials, Acta Pharmaceutica Sinica B, Journal of Controlled Release, Applied materials today, Acta Biomaterialia, Anal chem, Biosensor and Bioelectrics等国际知名学术期刊发表论文100余篇，总影响因子达到240，论文他引2000余次。

课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/Biomedicine-HNU

湖南中医药大学药学院王炜教授：长江学者特聘教授，国家百千万人才工程入选者，“有突出贡献中青年专家”，湖南中医药大学药学院副院长，创新药物研究所副所长，湖南中医药大学中医药民族医药国际联合实验室主任。Karachi University、澳门科技大学、温州医科大学、长春中医药大学、陕西中医药大学、西南民族大学、湖南医药学院等客座职教授或特聘专家，柳州市政府顾问。主要从事中医药民族医药药效物质基础与分析研究。主持国家自然科学基金、国家863课题和国际合作课题多项。先后在国内外期刊发表中英文论文200余篇。获授权专利10项。担任Bentham Science国际期刊 Current Chinese Science-Natural Products Section 主编和 Current Traditional Medicine执行主编；Current Medicinal Chemistry , Current Cancer Drug Target, Chinese Herbal Medicine, World Journal of Traditional Chinese Medicine等的编委。

资助信息

该研究得到了国家自然科学基金委（82003931）, 湖南省自然科学基金项目（2021JJ30096、2023JJ40130）和宁夏自治区重点研发计划项目（2022BFH02013）的支持。

原文信息

Ying Long^#, Jialong Fan^#, Naduo Zhou^#, Jiahao Liang, Chang Xiao, Chunyi Tong, Wei Wang*, Bin Liu*. Biomimetic Prussian Blue Nanocomplexes for Chemo-photothermal Treatment of Triple-negative Breast Cancer by Enhancing ICD. Biomaterials 2023, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2023.122369              IF: 12.8 Q1 B1.

原文链接

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961223003770

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