2024年8月，湖南大学生物学院刘斌教授团队在期刊【Chemical Engineering Journal】上发表题为“Multifunctional Chi-Ag@HMPB@CBD nanocomposites for eradicating multidrug-resistant bacteria and promoting diabetic damaged tissue repair”的研究论文。
标题
多功能Chi-Ag@HMPB@CBD 纳米复合材料用于根除多重耐药菌并促进糖尿病损伤组织修复
受伤组织容易受到多种微生物感染，导致血液供应不足、氧化应激过度和炎症，严重影响皮肤再生。然而，MRSA 感染使身体容易受到其他形式的细菌感染，并导致难以消除的多种微生物伤口感染的产生。因此，迫切需要制定有效的策略来治疗多种细菌感染和受损组织以及组织修复以进行临床治疗。在此，我们通过载有大麻二酚 （CBD） 和壳聚糖改性银纳米颗粒 （Chi-Ag NPs） 的空心介孔普鲁士蓝纳米颗粒 （HMPB NPs） 设计了新的 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 纳米复合物，以处理多种细菌感染的受损组织。体外实验表明，Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 与 CBD 和 Chi-Ag NPs 协同作用，通过破坏细胞膜和已建立的生物膜，有效杀死耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA） 和大肠杆菌 （E. coli） 的混合物。同时，Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 可以分解 H2O2并增加 O2水平，从而缓解微环境缺氧并保护细胞免受氧化应激损伤。此外，Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 可以通过抑制基质金属蛋白-9 （MMP-9） 表达来促进人脐静脉内皮细胞 （HUVECs） 的增殖、迁移和新生血管形成。体内实验表明，Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 对大肠杆菌和 MRSA 的混合感染表现出高效，通过上调血管内皮生长因子 （VEGF） 和血小板内皮细胞粘附分子-1 （CD31） 的水平来加速受损组织的修复。总的来说，这项研究表明 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 是多功能纳米材料，在临床治疗混合细菌感染的受损组织修复方面具有巨大潜力。
Chi-Ag@HMPB@CBD NPs制剂及其抗菌和组织修复治疗机制示意图。
图 1.Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 的表征。（A） 将不同浓度的 Chi-Ag 与不同浓度的 CBD 相结合杀死 MRSA 细菌的有效性。（B） 用不同比例的 HMPB NPs 和 CBD 合成的 CBD 负载率。（C） 用不同比例的 Chi-Ag NPs 和 HMPB@CBD NPs 合成的 Chi-Ag NPs 的负载和封装速率。HMPB NPs （D） 和 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs （E） 的 TEM 图像。（F） TEM 中粒度的定量。Chi-Ag NPs、HMPB NPs、HMPB@CBD NPs和Chi-Ag@HMPB@CBD NPs的动态光散射（DLS）测量（G）和Zeta电位（H）。（I） Chi-Ag@HMPB@CBD NPs的XPS光谱。（J） HMPB NPs、Chi-Ag@HMPB@CBD NPs和CBD的FT-IR光谱。
图 2.体外 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 的抗氧化性。（A） ox-TMB 在不同样品下的吸光度。（B） 不同 H2O2 浓度下 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 的 Michaelis-Menten 拟合曲线。（C） 不同溶液中 DO 浓度在不同时间的变化。（D） 不同组分对 DPPH 自由基清除能力的影响。（E） 不同成分在H2O2（1 mM） 刺激的 HUVECs 模型的ROS 荧光图。（F） ROS 荧光水平的定量。
图 3.Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 的体外抗菌作用。（A） 涂有差异处理的MRSA、大肠杆菌和混合细菌的 LB 琼脂板的照片。PBS 和万古霉素分别作为阴性或阳性对照。MRSA（B） 、E. coli（C） 和混合细胞 （D） 在不同处理下的细菌活力。（E） 用钙黄绿素 AM/PI 染料染色的MRSA和大肠杆菌细胞的活/死图像。MRSA和大肠杆菌细胞用 PBS、万古霉素、Chi-Ag、CBD 和 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 处理。（F） 和 （G） 是荧光图像的相应定量测定。（H） 用不同成分处理后残留的 MRSA、大肠杆菌和混合细胞生物膜的照片。MRSA（I）、大肠杆菌 （J） 和混合细菌 （K） 生物膜的相对残留分析。
图 4.Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 的抗菌机制研究。（A） MRSA 和大肠杆菌细胞在用 PBS、HMPB NPs、Chi-Ag、CBD、Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 处理后的 SEM 图像。（B） MRSA 和大肠杆菌的ROS荧光图像。（C） 和 （D） MRSA 和大肠杆菌细胞中相对 ROS 水平。（E） 和 （F） MRSA 和大肠杆菌细胞中 ATP 水平的图。（G） 和 （H） 用不同处理的 MRSA 和大肠杆菌的核酸泄漏水平。
图 5.体外促进 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 的伤口愈合。（A） 通过流式细胞术对 HUVECs 进行细胞周期分布测定。（B） HUVECs 细胞中细胞周期分布的定量评估。（C） HUVEC 管在不同处理下孵育后形成的荧光图像。（D） 成型管总支管长度和连接处的定量评估。（E） 不同处理下 HUVECs 细胞迁移的数字图像。（F） 细胞迁移的定量评估。（G） MMP-9 的 Western blot 图像。
图 6.Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 多发性感染皮肤伤口愈合的体内治疗。（A） 大肠杆菌和 MRSA 多发性感染伤口的示意图和 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 的治疗特征。（B） 五组小鼠在 0、1、3、5、7、9 和 11 天后感染伤口变化的照片。（C） 伤口愈合过程示意图。（D） 每组小鼠伤口面积的统计图。（E） 每组小鼠的体重图。（G）治疗后伤口细菌计数的评估。
图 7.感染伤口组织的病理图像。（A） 感染伤口切片的 H&E 和 Masson 染色图像。（B） 伤口组织中 VEGF、CD31 和 MMP-9 的免疫组织化学图像。各种处理后 （C） VEGF 、 （D） CD31 和 （E） MMP-9 的阳性水平。
图 8.Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 皮瓣修复的体内治疗效果。（A） 体内治疗示意图。（B） 第 1 天、第 3 天、第 5 天和第 7 天不同处理的对照和Chi-Ag@HMPB@CBD NPs组的皮瓣照片。（C） 每组皮瓣坏死面积统计图。（D） 每组小鼠的体重图。（E） 皮瓣切片的 H&E 和 Masson 染色图像。（F） 伤口组织中 VEGF 和 CD31 的免疫组织化学图像。各种处理后 （G） VEGF 和 （H） CD31 的阳性水平。
图 9. 体内高血糖小鼠细菌感染的皮瓣再生 （A） 大肠杆菌和 MRSA 多个感染伤口的示意图和 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 的治疗特征。（B） 4 组小鼠感染伤口在 1、3、5 和 7 天后变化的照片，治疗后皮瓣中细菌的照片。（C） 每组皮瓣坏死面积统计图。（D） 每组小鼠的体重图。（E） 治疗后伤口细菌计数的评估。
图 10.感染伤口组织的病理图像。（A） 感染伤口切片的 H&E 和 Masson 染色图像。（B）血管生成和伤口愈合相关因子 VEGF、CD31、HIF-α、α-SMA，细胞凋亡和炎症因子 NLRP3 的免疫组织化学染色。
总结与展望
在这项研究中，我们成功设计制备了 Chi-Ag@HMPB@CBD NPs，它具有广谱抗菌作用，可以促进受损组织的修复。体外实验表明，Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 可以与 CBD 和 Chi-Ag NPs 配合破坏混合细菌生物膜和细胞膜，产生 ROS，抑制 ATP 形成，泄漏核酸，并杀死 MRSA 和大肠杆菌和混合物种细菌。此外，Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 可以通过抑制 MMP-9 表达来促进 HUVECs 细胞增殖、迁移和新血管形成。重要的是，Chi-Ag@HMPB@CBD NPs 可以缓解缺氧环境，有效促进新血管的形成和新肉芽组织的形成，抑制细胞凋亡，减少炎症反应。我们的研究为治疗感染受损组织提供了一种有效的策略。
文献链接
https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.155035IF: 13.3 Q1
作者简介
第一作者：尹彩云，湖南大学生物学院2024届硕士毕业生，湖南大学生物学院科研助理，主要研究方向为构建新型中草药小分子纳米材料用于治疗糖尿病伤口感染及愈合。
通讯作者：刘斌，湖南大学教授，博士生导师，中国民族医药协会委员，湖南中医药大学中药民族药创新发展实验室学术委员会委员。1994年毕业于湖南师范大学生物系，2001年于中南大学肿瘤研究所获硕士学位，研究方向为鼻咽癌发病分子机制；2002年至2007年在湖南大学攻读博士学位，研究方向为纳米荧光探针与肿瘤生化分析，2007年9月赴美国Texas Tech University 医学院开展博士后研究，研究内容为肾类疾病分子机制。目前研究方向主要集中在药用植物活性成分群的靶向筛选、抗肿瘤、心血管疾病的天然药物靶向递送和抗感染复合纳米材料研究。先后主持和参与各类科研项目20余项，以第一和通讯作者身份在ACS Nano,Biomaterials, Journal of Controlled Release, Applied materials today, Acta Biomaterialia, Analchem,Biosensor and Bioelectrics等国际知名学术期刊发表论文100余篇，总影响因子达到240，论文他引2000余次。