湖南大学刘斌教授、龙樱助理教授和中南大学湘雅二医院袁丽琴副主任医师：基于日蟾毒它灵（CS-6）能有效抑制TNBC细胞中PD-L1的表达，利用减毒沙门氏菌靶向递送负载CS-6的羧基化普鲁士蓝纳米颗，构建“三位一体”肿瘤治疗新模式，通过高效诱导ICD，有效激活转移性TNBC的免疫治疗。
标题
光热响应的生物杂合体携载日蟾毒它灵高效诱导ICD用于转移性TNBC的多模式治疗
研究内容简介
日蟾毒它灵（CS-6）是一种从中国传统药物蟾酥中提取的主要活性化合物，在TNBC细胞中表现出强效的PD-L1抑制作用。尽管其在肿瘤治疗中具有潜力，但CS-6的医疗应用受到其疏水性、缺乏靶向能力以及较弱的免疫原性细胞死亡（ICD）效应的限制。为了克服这些限制并提高该药物对转移性TNBC的治疗效率，我们设计了一种整合羧基普鲁士蓝纳米颗粒（CPB NPs）、CS-6和减毒沙门氏菌（S.lux）的光热响应型生物杂合体（CS-6@CPB-S.lux），利用S.lux低氧环境的趋化性，实现CS-6@CPB NPs肿瘤组织靶向递送。结果表明，CS-6@CPB-S.lux通过光热疗法（PTT）和化疗的协同作用，有效杀伤TNBC细胞，并诱导ICD和抑制PD-L1表达，促进树突状细胞（DCs）成熟和效应T细胞活化，从而激活抗肿瘤免疫治疗；此外，CS-6@CPB-S.lux通过促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化和减少调节性T细胞（Tregs）的募集，显著改善了免疫抑制性的肿瘤微环境（TME），有效增强了抗肿瘤免疫治疗。动物体内抑瘤实验表明，这种多模式治疗不仅抑制了原位和远端肿瘤的生长，还减少了TNBC的肺和肝脏转移，显著延长了荷瘤小鼠的生存周期。
图 1. CS-6 可抑制 TNBC 细胞中 PD-L1 的表达。 (A) GEPIA 2 中 TNBC 组织（n = 135）和非癌组织（n = 291）中 PD-L1 的相对水平。 (B) GEPIA 2 中 PD-L1 高（n = 400）和 PD-L1 低（n = 400）的乳腺癌患者的无病生存率。 HR 表示危险比，p(HR) 表示危险比的概率。 (C和D）3个TNBC临床样本切片中PD-L1水平的代表性图像和IHC染色定量分析。 (E和F）3个TNBC组织（Ca）和癌旁组织（Pa）中PD-L1的Western印迹和定量分析。 (G）原发性人类乳腺癌的基因表达数据分析。 用皮尔逊相关检验比较 HIF-1α 和 PD-L1 的共表达。 (H）CS-6 处理 48 h 的 MDA-MB-231、BT549 和 4T1 细胞系中 HIF-1α 和 PD-L1 蛋白水平的变化。 (I) 50 nM CS-6 处理 MDA-MB-231 细胞 24 小时后 HIF-1α 通路相关基因 mRNA 水平的热图分析。 (J 和 K）HIF-1α 和 CD274 mRNA 表达水平的相对变化。
图 2. CS-6@CPB-S.lux 的特征。 (A) CS-6@CPB-S.lux 的示意图。 (B) 通过紫外-可见光检测（CPB NPs：25、50、100、150 和 200 μg/mL）搅拌 2 小时后 S.lux 上附着的 CPB NPs 数量（S.lux：108 CFUs）。 (C）CPB NPs、CS-6@CPB NPs、S.lux 和 CS-6@CPB-S.lux 的 TEM 图像。 (D) CPB NPs、CS-6@CPB NPs、S.lux 和 CS-6@CPB-S.lux 的粒度分布。 (E) CPB NPs、CS-6@CPB NPs、S.lux 和 CS-6@CPB-S.lux 的 Zeta 电位。 (F) CPB NPs 水分散液（1 mL，200 μg/mL）在激光（1.5 W/cm2）照射和关闭时的光热曲线，以及 CPB NPs 的线性冷却时间 vs - Ln (θ) 。 (G) 808 纳米激光照射（1.5 W/cm2）10 分钟后不同样品（CPB NPs，200 μg/mL）的温度变化。 (H) CS-6@CPB NPs 在不同 pH 值条件下经近红外激光处理后 CS-6 的累积释放量。 (I）不同浓度的 CS-6 对 S.lux 生命力的影响。 (J）S.lux 和 CS-6@CPB-S.lux 的荧光图像。 活的 S.lux 被 Calcein-AM 染成绿色，死的 S.lux 被 PI 染成红色。 (K）S.lux 和 CS-6@CPB-S.lux 的生长曲线。 细菌在 37 °C 的 LB 培养基中培养，在指定时间点测量 OD600。 (L)在固体 LB 琼脂上评估 S.lux 和 CS-6@CPB-S.lux 的生长情况。 (关于本图中颜色的解释，读者可参阅本文的网络版）。
图 3. CS-6@CPB-S.lux 的体外抗肿瘤作用。 (A) 不同处理后 4T1 细胞的存活率。 (B) 4T1 细胞球体内游离 RB、RB@CPB NPs 和 RB@CPB-S.lux 的 CLSM 图像。 球形细胞表面定义为 0 μm。 观察采用 z-stack 模式，平面间距为 10 μm。 (C和D）FCM分析和M1巨噬细胞（F4/80+CD80+标记）比例百分比。 (E）用 ELISA 试剂盒检测 TNF-α。 (F）三维 MTCs 构建实验示意图。 (G 和 H) CS-6、S.lux、CS-6@CPB + 激光或 CS-6@CPB-S.lux + 激光治疗后三维 MTCs 的代表性图像和生长曲线。 (I）经不同处理 5 天后三维 MTC 的活/死染色。 有活力的细胞被钙黄绿素-AM 染成绿色，死亡/晚期凋亡的细胞被 PI 染成红色。 用 CS-6@CPB-S.lux 处理 4T1 细胞和三维 MTC，浓度如下： CS-6 为 1 μM，CPB NPs 为 40 μg/mL，S.lux 为 104 CFUs。 处理后，使用激光照射（808 nm，1.5 W/cm2，3 分钟）。 以 PBS 作为对照。 (有关本图例中颜色的解释，读者可参阅本文的网络版）。
图 4. 体外 CS-6@CPB-S.lux 与 PTT 结合可诱导 ICD 并抑制 PD-L1 的表达。 (A) CS-6@CPB-S.lux + 激光治疗 4T1 细胞中 HMBG1 释放和 CRT 暴露的荧光图像。 (B) 检测不同处理后 4T1 细胞释放的 ATP 水平。 (C) BMDCs 成熟实验示意图。 (D) 不同处理后 BMDCs（CD11c+CD80+CD86+）的光学显微镜图像和 FCM 分析。 (E）成熟 BMDCs 的百分比。 (F 和 G）定量检测 BMDCs 悬浮液中的 IL-12p40 和 TNF-α。 (H）在不同条件下处理 48 小时的 4T1 细胞中 HIF-1α 和 PD-L1 蛋白水平。 细胞暴露于 CS-6@CPB-S.lux，浓度分别为 1 μM CS-6、40 μg/mL CPB NPs 和 104 CFUs S.lux，同时接受激光照射（808 nm，1.5 W/cm2，3 分钟）。 PBS 作为对照。 (I）CS-6@CPB-S.lux 的功能示意图。
图 5. CS-6@CPB-S.lux 在肿瘤小鼠体内的生物分布和肿瘤蓄积。 (A) 4T1 肿瘤小鼠在注射 107 CFUs S.lux 或 CS-6@CPB-S.lux 后 1、2 和 3 天的肿瘤成像。 (B) 注射后 3 天主要器官的荧光分布分析。 (C）LB 琼脂平板的代表性照片；（D）注射 S.lux 或 CS-6@CPB-S.lux 3 天后 4T1 肿瘤小鼠器官中 S.lux 定殖的定量分析。 (E）4T1 肿瘤小鼠注射 PBS、CS-6@CPB 或 CS-6@CPB-S.lux 后，在第 0.5、1、2 和 3 天用近红外激光照射 1-5 分钟的红外热图像。F）不同时间点照射 5 分钟后肿瘤部位温度变化的定量分析。
图 6. CS-6@CPB-S.lux 对 4T1 肿瘤小鼠的体内抗肿瘤疗效和免疫刺激作用。 (A) 实验设计示意图。 (B) (І) 对照组、(П) CS-6、(Ш) S.lux、(Ⅳ) CS-6@CPB + 激光和 (Ⅴ) CS-6@CPB-S.lux + 激光治疗后的单个肿瘤生长曲线（每组 n = 6）。 (C) 4T1 肿瘤小鼠在治疗后第 0、13 和 26 天的代表性物理照片。 (D) 第 26 天切除肿瘤的照片和 (E) 体重。 (F）与对照组相比，各治疗组的肿瘤抑制率（TIR）。 (G）用药 26 天后肿瘤的 H&E、Ki67 和 TUNEL 染色。 (H）治疗后的 Kaplan-Meier 生存曲线（每组 6 人）。 (I）肿瘤中 M1 巨噬细胞（用 F4/80+CD86+ 标记）和 M2 巨噬细胞（用 F4/80+CD206+ 标记）的比例。 (J)M1巨噬细胞和(K)M2巨噬细胞占总细胞的百分比。 (L-N）治疗肿瘤的 CRT 和 HMGB1 免疫荧光染色。 (O和P）对治疗后肿瘤引流淋巴结中成熟DC（CD11c+CD80+CD86+）的代表性流式细胞图和定量分析。 (Q-S）治疗后肿瘤中 HIF-1α 和 PD-L1 表达的代表性免疫荧光图像和定量检测。
图 7. CS- 6@CPB -S.lux 在体内的杀瘤、免疫刺激和抑制转移作用的研究。 (A) 体内治疗过程示意图。 (B) 接受不同治疗的小鼠腹腔肿瘤生长曲线。 (C和D）治疗25天后腹腔肿瘤的照片和重量。 (E-J）流式细胞术分析不同治疗后腹水瘤中的 CD8+ T 细胞、CD4+ T 细胞和调节性 T 细胞（CD4+ T 细胞门控的 CD25+ Foxp3+ T 细胞）。 (K）治疗后 25 天各组小鼠肺部切片的数码照片（转移瘤结节用白圈标出）。 (L）不同治疗小鼠肺组织中结节数量统计图。 (M）治疗后 25 天各组小鼠肺部切片的 H&E 染色图。 (N）各组小鼠治疗 25 天后肝脏的 H&E 染色。 (O）不同治疗组小鼠肝组织中结节数量统计图。
图 8. CS-6@CPB-S.lux 的生物相容性和生物安全性。 (A) 体内给药过程示意图。 (B) 治疗期间小鼠体重变化曲线。 (C 和 D）治疗后 14 天和 28 天的血液生化和血液学分析。 (E）治疗后 28 天心、肝、脾、肺和肾的 H&E 染色。
综上所述，本研究通过生物杂交构建的CS-6@CPB-S.lux，为抗转移性TNBC多模式治疗提供了一种“纳米药物-细菌”一体化的新策略。论文第一作者为湖南大学博士后范家龙和湖南中医药大学覃艳副教授，湖南大学刘斌教授、龙樱助理教授和中南大学湘雅二医院袁丽琴副主任医师为该文章的共同通讯作者。
课题组简介
湖南大学生物学院刘斌教授：
湖南大学教授，博士生导师，中国民族医药协会委员，湖南中医药大学中药民族药创新发展实验室学术委员会委员。1994年毕业于湖南师范大学生物系，2001年于中南大学肿瘤研究所获硕士学位，研究方向为鼻咽癌发病分子机制；2002年至2007年在湖南大学攻读博士学位，研究方向为纳米荧光探针与肿瘤生化分析，2007年9月赴美国Texas Tech University医学院开展博士后研究，研究内容为肾类疾病分子机制。
目前研究方向主要集中在药用植物活性成分群的靶向筛选、抗肿瘤、心血管疾病的天然药物靶向递送和抗感染复合纳米材料研究。
先后主持和参与各类科研项目20余项，以第一和通讯作者身份在ACS Nano, Biomaterials, Acta Pharmaceutica Sinica B, Journal of Controlled Release, Applied materials today, Acta Biomaterialia, Anal chem, Biosensor and Bioelectrics等国际知名学术期刊发表论文100余篇，总影响因子达到240，论文他引2000余次。
课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/Biomedicine-HNU
湖南大学生命医学交叉研究院龙樱助理教授：
湖南大学生命医学交叉研究院助理教授。2007年至2011年，湖南大学生物学院生物技术理学学士，2011年至2014年湖南大学生物学院生物化学与分子生物学理学硕士，2014年至2018年，中南大学湘雅医院病理学与病理生理学医学博士，2018年至2021年，湖南大学生物学院博士后，合作导师：刘斌，2021年至现在，湖南大学生命医学交叉研究院助理教授。
研究主要围绕恶性肿瘤的精准治疗展开，综合医学、药学、生物信息学、细胞生物学与分子生物学等学科的理论与方法，结合现代纳米技术开发新的载药系统与治疗手段应用于临床前研究。其次，致力于挖掘天然药物有效成分的作用机制，并利用纳米技术提升天然药物的综合性能与临床应用范围。
代表论文：
1. Long Y, Wang Z, Fan JL, Yuan LQ, Tong CY, Zhao YZ*, Liu B*. A hybrid membrane coating nanodrug system against gastric cancer via VEGFR2/STAT3 signaling pathway, Journal of Materials Chemistry B. 2021, 9(18): 3838-3855.
2. Long Y, Wu XJ, Li Z, Fan JL, Hu X, Liu B*. PEGylated WS2 nanodrug system with erythrocyte membrane coating for chemo/photothermal therapy of cervical cancer. Biomaterials Science, 2020, 8(18): 5088-5105.
3. Wang Z1, Long Y1, Fan JL, Xiao C, Tong CY, Guo CL, Chen XiY, Liu B*, Yang XP*. Biosafety and biocompatibility assessment of Prussian blue nanoparticles in vitro and in vivo. Nanomedicine (Lond). 2020, 15(27): 2655-2670.
中南大学湘雅二医院袁丽琴副主任医师：
袁丽琴，中南大学湘雅二医院，普外乳甲专科，副主任医师，博士。2006年于中南大学湘雅医学院，获医学学士学位，2009年于中南大学湘雅医学院获临床医学硕士学位，2014年于中南大学湘雅医学院获外科学博士学位。
擅长乳腺纤维瘤、乳腺增生、男性乳房肥大、乳腺原位癌、乳腺囊性增生、乳腺导管内乳头状瘤、乳腺导管扩张、乳腺炎、弥漫性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌、甲状腺囊肿、甲状腺恶性肿瘤、甲状腺未分化癌、甲状腺滤泡状癌等疾病的治疗与诊断，尤其是乳腺、甲状腺肿瘤的微创诊疗，乳腺癌改良根治术，乳腺癌的综合治疗及甲状腺肿瘤的手术治疗。
参与国家级、省级科研课题3项。在国内外核心期刊杂志已发表学术论文十余篇，参编著作1部。
资助信息
该研究得到了湖南省自然科学基金（2023JJ40130, 2023JJ30799）、宁夏自治区重点研发项目（2022BFH02013）以及湖南省青年科技创新人才项目（2021RC3100）的的支持。
原文信息
Fan Jialong#, Qin Yan#, Qiu Wensheng, Liang Jiahao, Xiao Chang, Xie Qian, Tong Chunyi, Yuan Liqin*, Long Ying*, Liu Bin*. Gamabufotalin loaded micro-nanocomposites for multimodal therapy of metastatic TNBC by efficiently inducing ICD. Biomaterials. 2025;314:122851
原文链接
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961224003855
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