发夹自锁型脱氧核酶探针用于活细胞内miRNA的放大检测

MicroRNA（miRNA）在基因表达的调控、免疫细胞的分化和发育以及肿瘤的发生、发展等方面发挥着重要作用。准确、灵敏地检测miRNA对于疾病，特别是癌症的诊断具有重要的意义。然而，绝大多数的microRNA在细胞内丰度较低，且细胞内环境复杂。传统的miRNA检测技术需要裂解大量细胞，得到的结果只是细胞群体中miRNA的平均表达，因此发展活细胞内miRNA的原位放大检测技术具有重要的意义。脱氧核酶（DNAzyme）是通过体外筛选技术获得的具有酶活性的单链DNA片段，由于具有高催化活性、高选择性、易修饰、易合成等优点，DNAzyme已经成功用于构建各种具有放大功能的分子探针。另外，与传统的蛋白酶相比，DNAzyme能重复多次地变性、复性而不丧失酶活性，因此很适合用于细胞内对目标物质的高灵敏检测。

近日，湖南大学化学化工学院、化学生物传感与计量学国家重点实验室、生物纳米与分子工程湖南省重点实验室的王柯敏（点击查看介绍）课题组利用金纳米颗粒作为载体，巧妙地将DNAzyme、底物链以及识别链整合到一条封闭的发夹结构里，设计了一种通用型DNAzyme探针用于活细胞内miRNA的放大检测。探针的工作原理如图1所示，该探针包含金纳米颗粒和发夹探针两部分，其中金纳米颗粒作为载体和荧光淬灭剂使用。当目标miRNA不存在时，发夹探针的特殊构型使DNAzyme的酶活性受到抑制，荧光基团靠近金纳米颗粒表面致使荧光淬灭。当目标miRNA存在的情况下，发夹探针与目标miRNA杂交使探针的构型发生变化，DNAzyme形成活性二级结构，在辅因子镁离子的协助下对底物链进行切割，导致标记荧光基团的短链远离金纳米颗粒表面而发出荧光，同时由于底物被切断使其与目标miRNA的结合不够紧密，目标miRNA随后被释放，继续进入下一轮的“杂交-切割-释放”循环。该方法由于目标miRNA可循环利用并产生荧光信号，能够实现荧光信号的放大功能，从而显著提高灵敏度。新方法对于目标miRNA的检测限为25 pM。由于镁离子是细胞内浓度最大的二价阳离子，作者选择以镁离子作为辅酶的10-23DNAzyme用于探针设计，实验结果（图2）显示该探针仅依靠细胞内自身镁离子的浓度（无需外加镁离子）便可以保证探针的正常工作。

图1. 基于金纳米颗粒和发夹自锁型脱氧核酶的荧光探针用于活细胞内miRNA的放大成像。

图2. 不同条件下细胞内目标miRNA的实时荧光成像。

这一研究成果发表在美国化学会旗下的Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2017, 89, 5850）上。湖南大学2012级的博士生杨艳婧同学是论文的第一作者，化学化工学院的王柯敏教授和黄晋教授为论文的通讯作者。此外，该课题组在利用DNAzyme构建探针用于细胞内重要生命物质的分析检测方面还做了一些相关的工作，2016年报道了一种基于核酸适配体核酶（aptazyme）和金纳米颗粒构建的荧光探针用于活细胞内ATP的放大检测，并发表在Analytical Chemistry （Anal. Chem., 2016, 88, 5981）上。另外，最近该课题组还利用裂开型DNAzyme和金纳米颗粒构建的探针成功实现了细胞内miRNA的放大检测，研究成果也发表在Analytical Chemistry （Anal. Chem., 2017, 89, 8377, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b00174）上。

参考文献：

(1)Yanjing Yang, Jin Huang, Xiaohai Yang, Ke Quan, He Wang, Le Ying, Nuli Xie, Min Ou, Kemin Wang. Aptazyme-gold nanoparticle sensor for amplified molecular probing in living cells. Anal. Chem., 2016, 88, 5981-5987.

(2)Yangjin Yang, Jin Huang, Xiaohai Yang, Xiaoxiao He, Ke Quan, Nuli Xie, Min Ou, Kemin Wang. Gold nanoparticle based hairpin-locked-DNAzyme probe for amplified miRNA imaging in living cells. Anal. Chem., 2017, 89, 5850-5856.

(3)Yanan Wu, Jin Huang, Xiaohai Yang, Yanjing Yang, Ke Quan, Nuli Xie, Jing Li, Changbei Ma, Kemin Wang. Gold nanoparticle loaded split-DNAzyme probe for amplified miRNA detection in living cells. Anal. Chem., 2017, 89, 8377-8383.

导师介绍

王柯敏

http://www.x-mol.com/university/faculty/10117