深圳大学孟思/孔湉湉AFM：多材料数字光处理（DLP）生物打印具有可渗透网络的异质水凝胶构建体

构建体外模拟活组织和器官的模型具有巨大的潜力。这些模型可能会为创造用于组织再生的植入式生物材料带来突破并为有效的药物和毒性筛查提供平台。挑战在于开发能够模拟生理或病理条件复杂性的技术，包括活细胞、细胞外基质和专门的生物材料。自上而下的生物制造技术可以将细胞和生物材料操纵成预先确定的、空间排列的结构，从而制造出厘米大小的模型。这些模型能够捕捉组织和器官的基本结构细微差别和功能。在自上而下的方法中，无论是基于挤出的、还是基于光照的 3D 生物打印都很普遍。基于挤出的方法将充满细胞的“生物墨水”沉积在分层图案中以形成 3D 结构。这些方法适用于广泛的生物材料，但它们面临着低分辨率（≈200微米）和结构简单等局限性。尤其是在创建具有管腔的复杂自由曲面结构时，这种方法面临着挑战。

近日，来自深圳大学孟思副研究员和孔湉湉教授在Advanced Functional Materials 杂志发表研究论文，提出了利用生物墨水PEGDA-AAm和多材料数字光处理（DLP）生物打印来开发多组分、多模量、充满细胞的水凝胶构建体。这些结构具有异质的机械性能、复杂的结构和精确设计的表面微观结构。

使用多材料DLP打印并将AAm和PEGDA分别作为水凝胶的软硬结构组分混合来制备水凝胶前体

为了打印水凝胶构建体，使用了一台基于DLP技术的打印机 (nanoArch S140, 重庆摩方精密科技有限公司)，其LED光源波长为405纳米，最大光强约为100毫瓦/平方厘米，用于固化水凝胶前体（见图1）。为了制备DLP打印机的生物墨水，研究者通过混合AAm和PEGDA来制备水凝胶前体，分别作为水凝胶的软和硬结构组分。配方还包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂（LAP）作为光引发剂，以及红色食用染料作为光吸收剂。所有使用的试剂都具有优良的生物相容性，这是选择它们的关键因素。

图1. 用作体外模型的水凝胶构建体的示意图

PEGDA-AAm生物墨水的性能表征

生物墨水的凝胶化时间（T_gel）显著影响其可打印性。对25、35和50 wt%浓度的PA生物墨水进行照射交联10秒。结果显示，低浓度的PA生物墨水仅部分凝胶化，当瓶子倒置时未固化的墨水沿瓶壁流下。相反，50 wt%浓度的PA生物墨水显示完全凝胶和固化，几乎没有墨水流动。这表明50 wt%的PA生物墨水更适合创建复杂的结构（图2A）。

为了定量确定PEGDA-AAm（PA）生物墨水的凝胶化时间（T_gel），对其光流变性能进行了表征。当储存模量（G'）与损耗模量（G''）相匹配时，确定了T_gel。将PA生物墨水的单体浓度提高会导致T_gel降至2.75秒（图2B），这比通常需要几十秒的GelMA的凝胶化时间要快得多。

在DLP 3D生物打印中，优化打印分辨率涉及调节未固化墨水的粘度和固化后水凝胶的刚度。这对确保固化结构与残留液体墨水之间的清晰分离至关重要。这些属性的相互作用通过固化后水凝胶的G'和未固化墨水的G''来定量捕捉。打印分辨率的有效性由这些模量的差异（ΔG）决定。比较不同单体浓度的PA生物墨水的ΔG，发现50%单体浓度的PA生物墨水的ΔG要高一个数量级（图2C）。鉴于其较短的T_gel和较高的ΔG，50%单体浓度的PA生物墨水更有希望增强可打印性，成为了后续实验的首选。

为了优化曝光参数，研究者们探索了曝光参数对XY平面和Z方向的打印分辨率的影响。研究者发现，使用较高的光能来打印100 µm宽的凹槽会导致过固化。相比之下，较低的光能使得相同宽度的凹槽的打印精度提高到了约90%（图2D）。在较高的光能水平下，精度降低的原因是因为在没有光吸收剂的情况下，生物墨水中的光散射增加，导致凹槽变窄。对于30 µm宽的凹槽，在较高和较低的光能下的打印精度分别为53%和60%。在创建细微的平面结构时，可通过调整光强度和曝光时间从而精确控制所得到的打印宽度。

向生物墨水中添加光吸收剂可以有效提高打印精度。光吸收剂均匀混合到墨水中后可降低不同区域的光能。它们吸收大部分散射光，显著减少了不必要的固化，从而提高了打印精度。然而，虽然较高浓度的光吸收剂可以增加精度，但也可能导致固化层变薄，影响打印效率。研究者发现，将1%的光吸收剂添加到PA生物墨水中可以实现最佳平衡，既确保了高打印精度，又保持了效率（图2E,F）。

在PA生物墨水中，研究者成功地将得到的PEGDA-AAm水凝胶的弹性模量调整在数十到数百kPa的范围内。仅通过控制单体浓度和PEGDA:AAm（PA）比例来实现这一点。具有2%、5%和10%比例的特定PA墨水被分别命名为PA1、PA2和PA3。这些水凝胶的弹性模量在45至210 kPa之间，应变范围从90%到350%不等（如图2G,H所示）。PA水凝胶在水环境中表现出了良好的结构完整性和尺寸稳定性，使其成为体外模型建设中的理想支架材料。例如，PA1水凝胶在浸泡在水中7天后的重量几乎保持不变，这意味着PA1水凝胶没有水解（图2I）。这种稳定性是由于PA水凝胶与双网络的强化学交联，确保了水凝胶的结构在较长时间内保持完整，即使在PBS溶液中也是如此。鉴于这些性质，PA水凝胶可以用于构建各种组织的模型。

对于生物打印组织模型，生物墨水的细胞相容性和固化后的水凝胶的机械性能对于确保封装细胞的生存和正确表型至关重要。为了研究PA生物墨水在构建体外生物模型中的潜力，研究者接下来检查了PA1、PA2和PA3水凝胶与NIH-3T3细胞的兼容性，包括细胞毒性和增殖率。在第7天，所有PA水凝胶样品上的NIH-3T3细胞均表现出了高细胞存活率，超过了90%，并且每天的增殖率几乎超过了100%（图2J）。这些结果突显了软性和硬性PA水凝胶的出色生物相容性，这些水凝胶作为支持细胞生长的基质材料具有巨大的潜力。

图2. PA生物墨水的物理特性、可打印性和细胞相容性。

使用PA生物墨水构建单组分体外组织模型

为展示DLP生物打印在制备具有可灌注网络的细胞载体水凝胶结构方面的潜力，研究者创建了微流控芯片，其中包含直通和气管状通道。为验证结构内部成功打印了空腔通道，将显示蓝色荧光的NIH-3T3细胞注入到这些通道中（图3A）。研究者展示了两种不同水凝胶构建物的成功制备，其中包含嵌入的空心结构（图3B，E）。混合到生物墨水中的Hela-GFP细胞在整个水凝胶中均匀分布，而注入的NIH-3T3细胞充满了空心通道，它们的蓝色荧光清晰地勾勒出这些嵌入式微通道。绿色荧光的Hela-GFP细胞与蓝色荧光的NIH-3T3细胞之间的清晰区别（图3C，D，F，G），每个细胞都限定在特定区域。这些结果表明，在DLP打印中使用的PA生物墨水非常有效，可以制造具有精确灌注通道的模型，确保水凝胶构建物中特定细胞的均匀分布。

水凝胶构建物的表面拓扑结构在影响细胞行为方面起着关键作用，因此创建具有特定表面拓扑微结构的水凝胶构建物至关重要（图3H）。为评估这些表面拓扑微结构对细胞行为的影响，研究者设计了两种类型：螺旋槽微结构和基于三周期最小曲面（TPMS）的微结构（图3I，M）。使用蛋白质染色和共聚焦显微镜来评估这些微结构水凝胶上平滑肌细胞的取向。结果表明，螺旋槽上的细胞核和红色SMA均匀分布在表面上（图3K），而SMA的方向大致与槽的方向一致（图3L）。这表明螺旋槽可以有效地指导平滑肌细胞的生长方向。对于TPMS样品，细胞主要占据了TPMS多孔支架的线性“脊”结构，并以圆形方式排列（图3O，P）。这些发现证实了通过DLP打印创建具有定制表面拓扑微结构的水凝胶构建物可以有效调节细胞行为。通过利用通过建模预设计的不同微结构，有很大潜力复制各种体外组织和器官结构。

图3. 充满细胞的PA水凝胶构建体具有可灌注网络和工程表面形貌。

使用PA生物墨水构建单组分体外组织模型

在组织工程中，复制肝小叶、皮肤和软骨等组织和器官固有的多样化机械模量是一个挑战。研究者利用多材料DLP技术和多功能PA生物墨水将具有不同机械特性的组件可靠地组装成单一的体外模型。例如，PA1和PA2水凝胶通过在它们的界面处固化未固化的PA生物墨水来实现它们之间的粘接（图4A）。结果表明，将两种尺寸相同但配方不同的水凝胶组合在一起，得到了具有适度且平衡的机械特性的水凝胶（图4B）。此后，在同一平面上打印PA1和PA3生物墨水的预设计图案，并允许它们相互连接（图4C）。总的来说，这种异质结构的整体机械性能取决于不同机械特性的不同组分如何配置和连接在一起。良好设计的结构布局可以确保应力均匀分布或指向更坚硬的区域，增强结构完整性和机械稳健性。

为了展示多材料DLP在制造与生物相关的异质组织模型方面的能力，研究者开发了一个简化的肝小叶模型（图4D），其中蓝色PA3和红色PA1生物墨水分别代表肝窦和肝板。由于NIH-3T3和Hela-GFP细胞在生物材料中的广泛应用，研究者选择了这两种细胞作为代表性例子。这些细胞类型被合并到了PA1和PA3生物墨水中，形成了一个平面的异质生物结构。这种成功创建的多组分模型展示了该方法在研究水凝胶材料中的细胞相互作用方面的潜力。这些材料在细胞类型和机械特性上都有差异，满足了不同组织模量的需求。

为了将对异质性的探索扩展到XY平面之外，并展示沿Z轴构建异质结构的可行性，研究者还设计了一个涉及具有TPMS拓扑结构的管状结构的实验。这个结构被分成了三个不同的部分，每个部分都使用具有不同模量的PA1、PA2和PA3生物墨水制作（图4G）。对这个集成样品进行的应力加载测试证实了不同组分在具有TPMS特征的中空管中的有效融合，展示了沿Z轴方向的异质模量。这种成功的集成展示了该方法在以3D方式创建复杂的多模量结构方面的潜力。

作为概念验证，研究者利用多组分、多模量水凝胶结构并配有表面微结构来研究细胞行为。众所周知，肿瘤细胞的粘附、增殖、迁移和侵袭行为与材料基质的特性密切相关。为了研究肿瘤细胞的优先迁移和生长，将Hela-GFP细胞引入到多组分TPMS结构中。PA1水凝胶上的Hela-GFP细胞在扩展方面比PA2和PA3部分上的细胞更加广泛，显示出与侵袭性侵袭行为相关的开放式、纺锤形态。相反，PA2、PA3水凝胶上的Hela-GFP细胞倾向于在凹陷区域内聚集，主要呈现圆形，几乎没有扩散迹象（图4J）。因此，模量约为40 kPa的水凝胶结构有利于宫颈癌肿瘤细胞的迁移和侵袭，而模量较高的水凝胶鼓励细胞聚集。本研究开发的模量差异化的异质结构提供了一种多功能方法，用于研究基质模量对各种细胞行为的影响。此外，这些结构还有望用于共培养系统，以研究异质细胞群体之间的相互作用，这对于增强工程组织的性能至关重要。

作为概念的进一步证明，研究者设计了多组分、多模量水凝胶结构，实现了具有异质机械性能的几何复杂的3D血管网络。其中动脉、静脉和毛细血管分别由不同模量的水凝胶代表（图4K，L）。在构建后，将内皮细胞植入到这些多组分、多模量水凝胶结构中。随后的CD31蛋白染色显示出血管生成标志物的成功形成，表明了在各种模量基质上存在连续的内皮层（图4M）。这一结果表明，这个精心设计的多组分、多模量水凝胶血管网络已经实现了初始的血管功能。该生物制造方法为开发更复杂和功能相关的组织模型铺平了道路，这对于推进对血管疾病的理解和治疗至关重要。

图4. 充满细胞的多材料异质水凝胶构建体。

本文使用多材料DLP打印方法创建异质模型，具有保持长期细胞功能的潜力。突显了多组分、多模量水凝胶结构在开发具有定制机械特性的复杂结构方面的潜力，为组织工程和再生医学提供了更复杂和功能相关的组织模型铺平了道路。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Multi-Material Digital Light Processing (DLP) Bioprinting of Heterogeneous Hydrogel Constructs with Perfusable Networks

Ming Yang, Lang Chu, Yanfeng Zhuang, Cheng Qi, Si Meng, Zhou Liu, Tiantian Kong

Adv. Funct. Mater., 2024, DOI: 10.1002/adfm.202316456

作者简介

孟思，深圳大学化学与环境工程学院副研究员，深圳市高层次人才。师从东华大学纤维领域知名学者朱美芳院士，主要从事纤维的制备与结构设计、智能可穿戴、生物支架材料等方面的研究，以第一作者及通讯作者在Advanced Functional Materials、Biomaterials、Nano Research、Small、Small Method等研究领域重要期刊上发表论文10余篇，参与编写纤维领域重要专著两部。

孔湉湉，国家级青年人才入选者，深圳大学医学部生物医学工程学院特聘教授、博导。主要研究领域为微流控技术在生物医学领域的应用和发展。迄今共90余篇高水平学术期刊论文发表，包括第一或通讯作者论文如 Nature Communications (3篇)、PNAS、Advanced Materials (3篇)、Angew Chem、Science Bulletin、Advanced Functional Materials (4篇)、Advanced Energy Materials (2篇)、ACS Nano（2篇）等。担任一区期刊Microsystem and Nanoengineering （IF=8.117）编委、Green Energy & Environment （IF=13.3）及InFoMat（IF=22.7）青年编委、中国化工学会理事、中国化工学会青年工作委员会委员、微化工专委会委员等。

https://www.x-mol.com/university/faculty/65810