天津大学张发光-马军安团队ACS Catal：羰基还原酶三参数定向进化立体发散合成氟代β-内酰胺母核

酶催化立体发散合成以获得具有多个立体中心的有机氟化合物的所有可能的立体异构体仍然是一个重要且具有挑战性的课题。近日，天津大学张发光-马军安团队与中国科学院天津工业生物技术研究所孙周通团队合作通过对羰基还原酶的挖掘与定向进化，建立了一个立体发散合成的生物催化平台，合成了四种具有两个相邻立体中心的手性氟烷基氨基酸酯。通过半理性CAST/ISM 策略的快速三参数协同进化提供了羰基还原酶BgADH的四突变体M5（A140K/L203T/G92A/V84I），它不仅对目标立体异构体表现出高的立体选择性（99:1 dr，99% ee），而且活性（k_cat/K_m）增强了6.3倍和热稳定性（T₅₀¹⁵）提高了4 °C。晶体结构分析和分子动力学（MD）模拟研究揭示了BgADH的两个残基（A140和F148）是控制立体选择性的关键位点。通过氟烷基底物谱扩展、克级反应（648 g L⁻¹ day⁻¹）和合成转化为手性氟代β-内酰胺（即抗生素碳青霉烯核心），进一步证明了合成的实用性。

图1 羰基还原酶羰基还原酶三参数定向进化立体发散合成氟代β-内酰胺母核。图片来源：ACS Catal.

首先，作者选择2-（苯甲酰胺甲基）-4,4-二氟-3-氧代丁酸酯（1a）作为模式底物，来源于Burkholderia gladioli 的羰基还原酶BgADH (WP_013688875.1) GEO1作为模式酶。通过同源序列比对以及高通量分子对接评估底物与酶结合能的理性筛选手段，对一系列羰基还原酶进行筛选过滤，最终得到16个催化活力较高的候选酶。随后，对其实验验证，来源于Aromatoleum aromaticum EbN1的AaADH (Genbank: CAI07428.1) GEO57可以92%产率及94% ee, 99:1 dr得到 (2R,3R)-2a构型产物。BgADH可以较高活性，99% ee和中等dr值得到(2S,3S)-2a目标构型产物。接着，利用指纹图谱分析选取了BgADH-WT (PDB ID: 8IJ6)催化口袋内5 Å 范围内G91, S93, G137, I139, 178, 140, F148, S154, G182, S183, L190, A191等11个氨基酸位点做单点饱和突变（SM）筛选，结合三密码子饱和突变（TCSM）策略选取I139, A140, F148三个氨基酸位点以及赖氨酸−天冬氨酸−天冬酰胺（K-D-N）作为构建单元构建小而精的组合突变库，得到了一系列能够得到单一目标构型 (2S,3S)-2a的突变体。其中，单突变体A140K催化效果最佳，94%产率及94% ee, 99:1 dr。同时，组合突变库中发现F148N可以得到反转构型 (2S,3R)-2a，99% ee, 84:16 dr。可知，A140和F148为BgADH的手性控制中心。在单突变体F148N基础上继续迭代I139, A140, L190, A191四个位点，最终得到BgADH-F148N/A191F可以99% ee, 94:6 dr得到反转构型 (2S,3R)-2a。最后，选取来源于Lactobacillus keffri DSM 20587的LkADH (GEO96)位模板，对L143, I144, L153, L195, V196五个位点进行SM筛选，得到LkADH-V196K可以99% ee, 90:10 dr得到 (2R,3S)-2a构型产物。

图2. 数据驱动挖掘和机制指导的基于CAST/ISM的羰基还原酶定向进化获取四种立体异构体。图片来源：ACS Catal.

接着，以BgADH-A140K为模板，继续提高该酶的活性和热稳定性。借鉴FRISM策略选取酶催化口袋外侧八个氨基酸残基G92, S93, M94, Q146, G193, L203, 240, Y206, L207, 设计DYA/KGC简并引物覆盖小位阻氨基酸，包括甘氨酸（G）、丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和半胱氨酸（C），构建单点饱和突变库（SM）进行筛选。实验得到G92A 和L203T两个突变体可提高催化活性，二者迭代后BgADH-A140K/G92A/L203T活力有增强效应。另外，在此基础上继续迭代提高热稳定性，根据B-factor策略选取酶表面B-因子较高的四个氨基酸位点A10, A24, V84, A230进行SM筛选，得到V84I可以增强热稳定性T₅₀¹⁵约4 ℃。最终得到了手性、活性和热稳定性同时提高的四突变体M5(BgADH-A140K/G92A/L203T/V84I)。另外，将活性和热稳定性提高的组合突变体G92A/L203T/V84I迭代到BgADH-F148N/A191F上，可以得到M8 (BgADH-F148N/A191F/L203T/G92A/V84I) 的活性和热稳定性也有所提高，且选择性保持。

图3. BgADH手性、活性和热稳定性三参数进化示意图。图片来源：ACS Catal.

利用最佳突变体M5进行放大实验，15 g L⁻¹ 1a在40 °C下0.5小时内仅用0.3 g L⁻¹冻干细胞在100 mL规模下完全转化，提供了相应的 (2S,3S)-2a，分离产率超过90 %，99:1 dr和99 % ee，时空产率（STY）为648 g L⁻¹ day⁻¹。此外，二氟甲基化的氨基酸酯2a在酸性条件下容易脱保护，以高产率得到相应的氨基酸3。用三苯基膦（PPh₃）和二硫代联吡啶 [(2-PyS)₂] 处理3，得到了的β-内酰胺4，并保持了dr和ee值。对游离羟基的进一步保护导致了相应的酯5。最后，该生物催化平台进一步应用于立体发散合成三氟甲基、单氟甲基、五氟乙基和简单甲基取代的β-羟基-β′-氨基酸酯2b−2e的所有可能的立体异构体。

图4. 放大实验、合成转化及底物谱扩展。图片来源：ACS Catal.

对M5进行机制解析，晶体结构分析和分子动力学（MD）模拟研究揭示了BgADH的两个残基（A140和F148）是控制立体选择性的关键位点。L203T/G92A突变通过影响活性位点区域内α-螺旋的构象分布来增强活性，V84I通过加强与相邻残基的氢键网络来提高热稳定性。

图5. BgADH晶体结构分析与分子动力学模拟研究。图片来源：ACS Catal.

总之，天津大学张发光-马军安团队与中国科学院天津工业生物技术研究所孙周通团队合作实现了酶催化氟代β-内酰胺母核的立体多样性合成，通过半理性CAST/ISM策略对羰基还原酶BgADH进行了三参数协同进化，四突变体的立体选择性、活性、热稳定性均得到了显著提高，并通过晶体结构分析和分子动力学（MD）模拟研究揭示了突变体的催化机制，且顺利实现了氟烷基底物谱扩展、克级反应和合成转化为手性氟代β-内酰胺。该工作近期发表于ACS Catalysis，文章第一作者为天津大学博士研究生梅泽龙、中国科学院天津工业生物技术研究所李聪聪博士和韩旭博士，通讯作者为中国科学院天津工业生物技术研究所孙周通研究员、天津大学马军安教授和张发光教授。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Enzymatic Stereodivergent Access to Fluorinated β‑Lactam Pharmacophores via Triple-Parameter Engineered Ketoreductases

Ze-Long Mei, Cong-Cong Li, Xu Han, Yu-Chen Tian, Shuo-Han Li, Weidong Liu, Ge Qu, Manfred T. Reetz, Zhoutong Sun,* Jun-An Ma,* and Fa-Guang Zhang* 

ACS Catal., 2024, 14, 6358–6368. DOI: 10.1021/acscatal.4c00945

通讯作者介绍

张发光，天津大学理学院化学系教授，博士生导师。2009年本科毕业于天津大学理学院，2014年博士毕业于天津大学理学院，师从马军安教授。2014年至2017年在以色列理工学院进行博士后研究，合作导师为Ilan Marek 院士。2017年至今在天津大学理学院化学系从事教学科研工作。研究方向为有机氟化学与不对称合成，近年来主要在新型含氟砌块设计合成与转化反应方面取得了系列成果，重点开发了系列二氟烷基重氮试剂、二氟烷基杂环与二氟烷基手性化合物的高效合成策略，以第一或（共同）通讯作者在Chem. Rev.、J. Am. Chem. Soc. (2)、Angew. Chem., Int. Ed. (4)、CCS Chem. (2)、ACS Catal (2)等高水平期刊发表学术论文50余篇。

https://www.x-mol.com/groups/zhang_faguang 

马军安，天津大学讲席教授，博士生导师，国家杰青。1991年于河南大学获得学士学位，1999年于南开大学获得博士学位，师从黄润秋教授。随后在周其林教授课题组担任科研助手，从事手性催化不对称合成和相关药物研究。2002年在法国国家科研中心（CNRS）精细化学研究所从事博士后研究（合作教授: Dominique Cahard）。2004年在德国马谱所（MPI）煤炭化学研究所从事博士后研究（合作教授：Manfred T. Reetz）。2005年7月至今，就职于天津大学。2005年度入选教育部新世纪优秀人才，2006年天津市“131”创新型人才培养工程第一层次人选，2012年获得国家杰出青年科学基金的支持，2018年获得中国化学会黄维垣氟化学奖。马军安教授一直致力于有机不对称化学和有机氟化学的研究工作，目前发表学术论文200多篇，论文他引次数一万余次。

https://www.x-mol.com/university/faculty/13330 

孙周通，研究员，博士生导师，低碳合成工程生物学重点实验室副主任，中科院百人，天津杰青。2012年博士毕业于中国科学院上海生命科学研究院微生物学专业；2012-2016年先后在新加坡南洋理工大学和德国马普煤炭化学研究所/马尔堡大学从事博士后研究。2016年至今，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员，课题组长。担任期刊Green Synthesis & Catalysis、Bioresources and Bioprocessing编委，生物学杂志副主任委员，生物工程学报编委；兼任工业酶产业技术创新战略联盟副秘书长，中国生物化学与分子生物学会酶学专业分会委员，中国微生物学会酶工程专委会委员，中国生物发酵产业协会酶制剂分会理事，中国科协天津市科技工作者协会监事长，天津化工学会常务理事、微生物学会理事等。团队围绕工业酶设计与绿色生物催化，重点开展酶分子工程、代谢工程与合成生物学等方向的基础与应用研究。近年来在领域主流期刊 Nat Commun，Nat Synth，Chem Rev，Chem Soc Rev，JACS，Angew Chem，Metab Eng等发表论文70余篇，主编参编酶工程专著5部，申请/授权中国发明专利30余项，获2021年中国微生物学会酶工程专委会优秀青年酶工程学家奖，天津市自然科学特等奖等。

https://www.x-mol.com/university/faculty/280743 

天津大学马军安课题组目前重点发展合成生物学+有机氟化学前沿交叉研究方向，欢迎具有酶催化与生物合成相关背景的学生联系报考。课题组主页：http://tjmos.tju.edu.cn/majunan/