湖南师大杨荣华、熊二虎团队Angew：通用crRNA酰化策略用于稳健的光启动CRISPR-Cas12a系统一管式核酸检测

CRISPR-Cas系统的时空调控对于精确的基因编辑和灵敏的分子诊断具有重要意义。近年来，CRISPR-Cas系统的活性调控已然成为科学研究的热点。其中光激活的CRISPR-Cas系统能够更好地从空间和时间维度上调控crRNA引导的Cas酶活性，因而受到科研人员的广泛关注。尽管光调控CRISPR-Cas系统活性方面已经取得了一些进展，然而在现有的光调控CRISPR体系中，光响应基团的修饰位置和数量往往受制于靶标核酸序列，即当更换靶标核酸时，需要对整个光控体系进行重新设计和优化，通用性比较差，限制了光激活CRISPR-Cas系统的应用。因此亟待开发一种通用且便捷的CRISPR-Cas系统光调控新方法。

近日，湖南师范大学杨荣华教授、熊二虎教授团队在Angew. Chem. Int. Ed.杂志在线发表论文，提出crRNA酰化策略，通过将光响应基团连接到crRNA的2'-羟基（2’-OH）上，以调控CRISPR-Cas12a系统的活性，而后将其应用于核酸检测。

本研究中，作者首先合成了光笼化试剂，随即通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了crRNA的笼化以及光诱导脱笼过程（图1）。而后又通过PAGE和荧光两种方法证实了光响应基团的引入都能有效抑制crRNA的功能，并在短时间的紫外光照射下快速恢复CRISPR-Cas12a的活性（图2a-e）。由于2’-OH是RNA核糖中的一个特征性官能团，不受crRNA序列的限制，他们也通过使用不同序列的crRNA实验证实了crRNA酰化策略具备在调控CRISPR-Cas12a系统活性的通用性以及便捷性（图2f-h）。

图1. crRNA酰化策略的提出及验证

图2. crRNA笼化和光诱导脱笼对CRISPR-Cas12a系统活性的影响

基于这一策略，作者整合了重组酶聚合酶扩增（RPA）和光启动的CRISPR-Cas12a反应，构建了一个通用且稳健的光启动一管式检测平台（PhOto-Initiated CRISPR-Cas12a System for Robust One-pot Testing, POIROT）。该POIROT平台可以检测低至1 copy/μL的SARS-CoV-2和HPV病毒核酸靶标，其灵敏度比传统的一步法高两个数量级，与两步法相当（图3）。

图3. POIROT的构建及其SARS-CoV-2标准物质检测应用

随后通过对150例人乳头瘤病毒（HPV）临床样本进行测试，POIROT展现出与金标准qPCR方法相当的灵敏度和特异性（图4），表明该方法在临床诊断方面具有很好的应用前景。

图4. POIROT和金标准方法qPCR检测临床HPV样本

总结与展望

由于crRNA酰化策略不受序列限制，该方法也更容易拓展到其他CRISPR系统（Cas13和Cas14）用于光激活一管式核酸检测。另外，考虑到较长波长的光学控制更适合应用于临床诊断和生物医学研究，可以利用酰化策略在crRNA链上引入可见光、红外甚至近红外响应的基团用于CRISPR活性的调控，将会促进光激活的CRISPR-Cas系统在基因编辑、疾病治疗、细胞成像等领域的应用。相关研究成果发表在Angewandte Chemie International Edition 上，该工作由国家自然科学基金、湖南省科技创新计划项目和湖南省研究生创新项目支持完成。湖南师范大学杨荣华教授和熊二虎教授为论文共同通讯作者，2021级博士刘朋飞为论文第一作者，硕士研究生林雅婷和卓晓华为共同第一作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Universal crRNA Acylation Strategy for Robust Photo-Initiated One-Pot CRISPR–Cas12a Nucleic Acid Diagnostics

Pengfei Liu, Yating Lin, Xiaohua Zhuo, Jiayu Zeng, Bolin Chen, Zhen Zou, Guhuan Liu, Erhu Xiong, Ronghua Yang

Angew. Chem. Int. Ed., 2024, DOI: 10.1002/anie.202401486

导师介绍

杨荣华

https://www.x-mol.com/university/faculty/332865