Nature Photonics：成像技术新突破——“超声发光分子成像”

医学成像技术是现代医学中不可或缺的一部分，它通过各种成像设备和方法，使医生能够直观地观察和评估患者体内的器官和组织，而无需进行侵入式手术。这些技术包括X光、超声、核磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和正电子发射断层扫描（PET）等。医学成像技术的应用，极大地提高了疾病的早期发现、诊断、治疗计划制定以及疗效评估的能力，对提升患者的生活质量和治疗成功率起到了至关重要的作用。在诊断方面，医学成像技术能够揭示出病理组织的形态变化，帮助医生识别肿瘤、感染、炎症或其他异常情况。在治疗过程中，成像技术可以指导外科手术、放射治疗或介入治疗的精准进行。此外，随着时间的推移，通过对患者进行定期成像检查，医生可以监控病情的进展和治疗效果，及时调整治疗方案。

分子成像是一种非侵入性的工具，用于可视化和定量分子和细胞生物过程，进行疾病的检测、诊断、预测和监测。光学成像是分子成像的一个重要组成部分，具有灵敏性高、特异性高和可实时检测等优势。目前，可通过光、化学/生化相互作用、放射性同位素或X射线等手段激发分子发光。然而，依赖实时光激发的荧光成像往往受到组织自发荧光的影响，降低了活体组织成像灵敏性和特异性。相比之下，化学发光、生物发光、Cerenkov发光或X射线激发发光，可以消除生物组织中的自发荧光。然而，生物发光或化学发光信号往往受到活体中酶微环境或底物分布的影响。Cerenkov发光或X射线激发发光成像通常需要高剂量的放射性同位素或X射线才能达到足够的成像对比度，这可能对正常组织造成损伤。

超声成像利用高频超声波来可视化人体内部，没有电离辐射损伤，是一种广泛应用、低成本、实时、非侵入性和安全的成像模式。基于这些优势，超声波具有作为激发分子发光的能量源的潜力。声致发光是一种在高强度超声作用下，液体空化而产生的微弱发光现象，然而，其发光效率低、发光强度弱、超声暴露时间长，发光寿命极短。“声致发光”是指当液体被高强度超声波空化时发生的微弱光发射。在声空化过程中，气泡的膨胀和收缩与声压同步，产生高温（可达10000 K）和高压（81 MPa）的气泡坍塌。剧烈的气泡振荡诱导了羟基自由基的形成，有时还伴随声致发光的发射。尽管早在1934年就报道了瞬态声空化产生的声致发光现象，但由于这种光发射是在极端条件下产生的，且发光效率和强度极低（约50计数/秒），声致发光并未被认为是一种有效的成像技术。在1998年至2002年间，化学发光底物（例如，荧光素、萤光素类萤火虫发光模拟物）被用来增强发光强度，这些底物能与活性氧物种发生反应。然而，这些系统中的发光强度仍然相对较低（1 - 2 × 10⁴ 光子 cm⁻² s⁻¹）。因此，声致发光成像的质量非常差，成像信号难以与小鼠的背景区分开（信噪比约为3），这种声致发光仅在文献中作为概念证明出现。低发光强度、复杂的成像操作和耗时的过程阻碍了“声致发光”在实践中的应用。 

近日，湖南大学宋国胜教授、张晓兵教授和谭蔚泓院士团队在光学顶级国际期刊《自然光子学》（Nature Photonics）上发表研究成果，他们针对光学成像领域发展过程中存在的上述问题，开发了一种创新的“超声发光分子成像”技术，利用超声波激发荧光分子在活体内产生发光信号，实现了高强度的光学信号输出。该成像技术通过两步内部能量转换实现：1）分子通过压电效应产生极化电荷，随后在超声波作用下通过压电催化产生大量的活性氧物质（机械能转变成化学能）；2）生成的活性氧物质通过化学发光过程与分子反应后发射光子（化学能转变成光能）。相较于传统的水的声致发光信号，该工作开发的超声激发发光分子在发光强度上提高了2000余倍；与荧光成像相比，超声激发发光成像由于超声信号和光学信号发射之间不存在信号串扰，信噪比提高了10倍，同时具备1.46毫米的空间分辨率和高达2.2厘米的组织穿透深度。该工作同时开发了两种成像模式来采集超声激发分子发光的信号：在超声激发停止后采集光子信号的延迟成像模式，和在超声激发期间采集光子信号的实时成像模式。随后，研究团队展示了该技术对皮下和原位脑肿瘤、原位胰腺癌、腹膜转移肿瘤和淋巴结进行体内成像的可行性。此外，研究团队利用可激活的超声激发分子发光探针展示了肿瘤免疫治疗或药物引起的肝毒性期间颗粒酶B和ONOO^-的体内分子成像。

图1.（a）各种发光分子的化学结构。（b）纳米粒子的制备示意图。（c）TD纳米粒子的代表性TEM图像。（d）纳米粒子的实物照片。

首先，作者通过合成、筛选多种类型的分子，如卟啉类分子、花菁类分子、BODIPY类分子、有机半导体聚合物分子、三蒽衍生物分子（TD）和A-D-A'-D-A 共轭分子等，寻找出了一批具有超声激发分子发光性能的分子，并将其转化为水溶性的纳米粒子（图1）。

图2. 延迟超声激发分子发光成像模式(左)和实时超声激发分子发光成像模式(右)实验装置示意图。

作者随之开发了超声-发光成像新仪器，该成像仪器具备两种超声发光信号采集模式：实时超声激发分子发光成像和延迟超声激发分子发光成像（图2）。该成像仪器采集光子的过程可简述为：超声发生器和换能器发出的超声波通过超声耦合剂将能量传递到发光分子后分子被激发发光，分子发射的光子信号由CCD相机实时记录。

图3.（a）延迟超声激发分子发光成像模式下各个纳米粒子的发光图。（b）延迟超声激发分子发光成像模式和（c）实时超声激发分子发光成像模式下的纳米粒子发光强度定量图。

作者分别通过实时超声激发分子发光成像和延迟超声激发分子发光成像这两种成像模式对分子的发光性能进行了验证和探究，探究发现：除了基于姜黄素和ir780纳米粒子外，各种纳米粒子都有超声诱导的发光光子发射。基于卟啉的纳米粒子(Ce6和F-PpIX)比基于BODIPY和花菁的纳米粒子(ICG和HD)表现出更高的发光强度。在半导体聚合物基纳米粒子中，PFODBT纳米粒子的发光强度最高。值得注意的是，在所有测试的纳米粒子中，TD纳米粒子（TD NPs）表现出最强的发光强度。与H₂O、PFODBT和ce6纳米粒子相比，TD NPs发光强度显著提高，分别提高了2389.6倍、71.6倍和71.3倍。随后，作者采集了纳米粒子在实时超声激发分子发光成像模式下的发光情况：与其他纳米粒子相比，TD NPs、卟啉纳米粒子和PFODBT纳米粒子表现出更强的发光强度（图3）。

图4. TD NPs的延迟超声激发分子发光成像性能。（a）不同超声频率(分别为30、40、50和100 kHz)激发的TD NPs的超声激发分子发光光谱。（b）不同激发时间下，TD NPs的超声激发发光图像(左)和强度(右)。（c）不同功率密度激发30 s后，TD NPs的超声激发分子发光强度。（d）超声激发15 s，不同浓度的TD NPs超声激发发光图像(左)和强度(右)。（e）通过不同厚度组织的TD NPs超声激发分子发光图像(上)和荧光图像(下)。（f）超声激发分子发光和荧光的信噪比与组织厚度的关系。（g）在不同功率密度激发TD NPs的实时超声激发发光图像(左)和强度(右)。（h）不同浓度的TD NPs在超声激发时的实时超声激发分子发光强度。

接下来，作者采用延迟超声激发分子发光成像模式，重点研究了TD NPs的发光性能。研究发现TD-NPs的超声诱导发光性能会受到以下因素的影响：成像模式、超声激发持续时间、超声激发功率密度、超声频率、纳米粒子表面活性剂种类、纳米粒子浓度，以及超声激发发光信号采集时间点。然而，超声激发分子发光光谱与超声激发频率无关（图4）。

图5. TD NPs的超声激发发光机理示意图。

在超声激发分子发光机制探索方面，作者全面表征了超声激发发光分子的压电效应、活性氧产生能力、活性氧诱导发光能力，揭示发光分子的超声波机械能-化学能-光能转换机制：在超声振动作用下，TD NPs通过压电效应产生极化电荷，通过压电催化产生活性氧（ROS）。随后这些ROS与TD分子发生反应，形成TD-•OH中间体(I)或二氧乙烷中间体(II, III)。这些二氧乙烷中间体(II, III)逐渐解离释放化学能，同时TD-•OH中间体(I)与O₂反应后C-C键断裂，化学能逐渐释放。最后，临近完整或被破坏的TD分子被中间体的释放的化学能激发，从而产生发光（图5）。

图6. 超声激发发光成像小鼠（a）原位脑胶质瘤、（b）原位胰腺癌、（c）皮下瘤、（d）腹膜转移瘤和（e）淋巴结。

超声激发发光粒子具有良好的细胞相容性，作者采用“延迟超声激发发光成像”模式，研究了它们在体内超声激发发光的能力。经静脉注射TD NPs后，原为脑肿瘤荷瘤小鼠在超声激发后头部区域出现出动态增强的信号，表明TD NPs的超声激发分子发光成像可用于点亮深部肿瘤。作者也使用TD NPs对胰腺荷瘤小鼠进行超声激发分子发光成像。同样地，随着探针尾静脉注射后时间的推移，原位胰腺荷瘤小鼠胰腺区域的信号也呈动态增加趋势。此外，作者还借助该成像粒子，分别对小鼠淋巴结、皮下瘤和腹膜转移瘤进行了精准成像（图6）。

图7. 酶响应的超声激发分子发光探针检测示意图。

酶在各种生物过程中起着至关重要的作用，对其活性进行动态成像具有重要意义。在本研究中，作者基于发光共振能量转移机制，提出了设计酶特异性响应的超声激发分子探针的构想，具体技术方案是通过在超声激发发光供体-受体对之间引入不同的酶可切割肽序列作为连接体。最初，作者引入了一种由颗粒酶B可切割的肽序列（Ile-Glu-Phe-Asp，IEFD）作为连接体，连接了TD-NPs（供体）和BHQ-3（受体），从而构建了颗粒酶B响应的超声激发分子发光探针（TD-Grz-BHQ），该探针可实现对颗粒酶B的特异、灵敏检测成像。基于上述发光共振能量转移机制，TD-Grz-BHQ可以作为一个通用平台，用于定制其他类型酶响应的超声激发分子探针。例如，通过使用不同的酶可切割肽序列作为连接体，如Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala（MMP-2可切割肽序列）和Asp-Glu-Val-Asp（Caspase-3可切割肽序列），作者分别构建了用于MMP-2和Caspase-3检测的探针（图7）。

图8. 颗粒酶B响应的TD-Grz-BHQ超声激发分子发光探针成像不同类型小鼠接受免疫治疗后肿瘤部位颗粒酶B的含量（a-d）、小鼠接受免疫治疗后的远端效应（e-h）。

癌症免疫治疗可增强宿主的免疫力，诱导长期的免疫记忆效应，抑制肿瘤的复发和转移。然而，不同肿瘤类型和治疗类型的免疫治疗效果差异很大。早期区分对治疗有反应的患者和无反应的患者将有助于对无反应的患者进行分类，使其远离无效的治疗。然而，在肿瘤体积分化之前，仍然很难区分对治疗有反应的患者和无反应的患者。颗粒酶B是一种丝氨酸蛋白酶，由CD8⁺ T细胞和自然杀伤（NK）细胞在免疫应答过程中释放，在介导癌细胞死亡中发挥着至关重要的作用。因此，开发实时、准确的颗粒酶B成像技术对区分不同肿瘤类型的免疫反应具有重要意义。在本研究中，作者使用TD-Grz-BHQ对颗粒酶B进行成像，成功地在两种肿瘤模型中区分了anti-PDL1治疗后的不同免疫反应（图8）。作者进一步研究了TD-Grz-BHQ超声激发分子发光成像在成像远端效应方面的潜力。肿瘤的远端效应是指免疫治疗不仅能消除原发肿瘤，而且还能抑制远处肿瘤的生长。然而，远端效应可能会受到肿瘤区域广泛存在的免疫耐受的阻碍，因此很难预测远端肿瘤免疫治疗的反应。为了解决这一挑战，作者使用TD-Grz-BHQ，通过颗粒酶B响应的超声激发分子发光水平实现了对接受奥沙利铂联合anti-PDL1治疗小鼠远端效应的准确评估（图8）。

总结

在本研究中，作者首次实现了通过两步内粒子能量转换过程达到强烈且体内的超声发光成像。这种超声光子成像信号可以通过两种模式收集：超声激励停止后的延迟超声发光成像和超声激励期间的实时超声发光成像。值得注意的是，超声发光成像的强度明显高于声致发光，并且与实时光学激发不同，它几乎没有背景噪声。与传统荧光成像相比，超声发光成像提高了信噪比、成像灵敏度和成像深度。此外，与X射线激活的发光、生物发光或切连科夫发光相比，超声发光成像为体内成像提供了几个关键优势，包括无辐射、手持激发、操作简便、安全以及不依赖昂贵的仪器。因此，超声发光成像能有效地映射皮下肿瘤、原位胶质母细胞瘤、腹膜转移瘤和淋巴结。

这一成果近期发表在Nature Photonics 上，文章的通讯作者是湖南大学宋国胜教授、张晓兵教授和谭蔚泓院士，第一作者是王友娟博士（湖南大学博士研究生、现中国科学院杭州医学研究所博士后）。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

In vivo ultrasound-induced luminescence molecular imaging

Youjuan Wang, Zhigao Yi, Jing Guo, Shiyi Liao, Zhe Li, Shuai Xu, Baoli Yin, Yongchao Liu, Yurong Feng, Qiming Rong, Xiaogang Liu, Guosheng Song, Xiao-Bing Zhang & Weihong Tan 

Nat. Photon., 2024, DOI: 10.1038/s41566-024-01387-1

导师介绍

宋国胜

https://grzy.hnu.edu.cn/site/index/songguosheng 

张晓兵

https://www.x-mol.com/groups/zhang_xiaobing 

谭蔚泓

http://hias.ucas.ac.cn/fzyxy/info/1082/1293.htm