李自达团队PNAS：基于明场沉淀产量分级的无标记多重核酸检测

核酸检测在传染病防控和遗传病检测中发挥着至关重要的作用。多重核酸检测技术，能够在单次检测中同时探测多个靶标，提高了检测效率、降低了成本，因而在医学和生物学领域有着广泛的应用前景。然而，目前多重数字核酸检测往往受到荧光标记技术的限制，其对环境要求高、设备昂贵，且荧光试剂可能抑制扩增反应，限制了其实际应用。

环介导等温扩增（LAMP）可以生成明场下可见的沉淀，且生成沉淀量与引物浓度有关，为解决荧光读取信号的缺陷、降低核酸检测的成本和复杂度提供了新思路。深圳大学生物医学工程学院的李自达助理教授课题组开发了一种基于明场沉淀产量分级实现的无需荧光标记的多重核酸检测方法。该方法以LAMP沉淀产量为检测标志，以明场成像代替荧光信号读取，利用深度学习算法分析扩增后液滴的明场图像，根据液滴内的沉淀形态判断液滴包含的靶标，从而实现多重数字核酸检测。这一创新性的方法无需使用荧光染料或特异性的荧光靶标，降低了核酸检测成本和操作复杂度，实现了无标记、低成本的多重核酸绝对定量。

该方法对于两种不同的核酸靶标的特异性引物设置不同的浓度，控制不同的靶标的反应深度不同，从而使不同靶标扩增产生的沉淀量不同。扩增后，在明场下拍摄液滴图像，并利用深度学习算法对于液滴明场图像进行分析，分析液滴中的沉淀形态，从而判断液滴中包含的靶标类型。根据沉淀产量将液滴分为空、仅含靶标一、仅含靶标二、同时含两种靶标等4类液滴。最后根据泊松分布计算样本中每种靶标的浓度。

图1. StratoLAMP流程示意图及沉淀分型

研究团队探究了沉淀生成量与引物浓度之间的相关性，并对影响沉淀生成和扩增反应的因素进行了系统性探究，包括底物浓度、镁离子、Bst酶浓度、扩增时间等，实现了对于扩增体系的优化。

研究团队开发了Mask R-CNN算法用以液滴分割及分类，通过对深度学习算法的训练和测试，研究团队证明了算法对四类液滴的分类性能良好，总体准确率达到94.32%。

图2. 深度学习算法根据沉淀形态进行液滴分类的准确率高

该方法与基于荧光的单重数字核酸检测方法得到的定量结果具有较高一致性，证明了StratoLAMP的多重数字核酸定量的准确性。

图3. StratoLAMP二重定量结果

总结与展望

StratoLAMP利用LAMP扩增生成的明场下可见沉淀，根据沉淀产量进行液滴分类，并利用深度学习算法高通量地分析液滴中生成的沉淀，从而实现多重数字核酸定量。这一创新方法为多重核酸检测提供了新思路，摆脱了荧光标记技术的限制，降低了成本。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

StratoLAMP: Label-free, multiplex digital loop-mediated isothermal amplification based on visual stratification of precipitate

Meichi Jin, Jingyi Ding, Yu Zhou, Jiazhao Chen, Yi Wang, and Zida Li

PNAS, 2024, DOI: 10.1073/pnas.2314030121

作者简介

李自达，深圳大学医学部生物医学工程学院助理教授。2012年在中国科学技术大学获热能动力工程学士学位，2018年在美国密歇根大学机械工程获博士学位，同年加入深圳大学任助理教授。研究兴趣聚焦于微纳工程与生物科技，为生物医学研究提供技术平台与研究工具。研究方向主要包括单分子核酸与免疫分析、单细胞测序等。

课题组网站：

https://zidalab.github.io/ 

https://www.x-mol.com/groups/zidalab 

金美池，深圳大学医学部生物医学工程学院硕士研究生。研究方向为高通量生物分子检测、蛋白质微阵列、微流控技术、微纳加工等。

丁婧怡，深圳大学医学部生物医学工程学院硕士研究生。研究方向为基于微流控技术的数字核酸检测。