南开大学刘定斌教授团队近年来重要工作概览——细胞外囊泡分离分析新策略

刘定斌，国家高层次人才，南开大学教授，博导，分析科学研究中心副主任。2006年本科毕业于兰州大学，2012年博士毕业于国家纳米科学中心，随后在美国国立健康研究院（NIH）开展博士后研究，2014年加入南开大学化学学院、药物化学生物学国家重点实验室。作为通讯作者在Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、Sci. Adv.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Nano Lett.等国际知名刊物上发表论文100余篇，多篇论文被选为期刊封面、Hot Paper及 ESI 高被引论文；论文他引6000余次，H因子38；已获授权专利十余项，并实现其中多项专利的成果转化；受邀担任Nanotheranostics 副主编、Targets 编委、《高等学校化学学报》青年编委、中国微米纳米技术学会微纳流控技术分会理事、中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会委员、中国生物材料学会体外诊断分会委员、中国感光学会光学传感与诊疗专业委员会委员、中国生物医学工程学会青年委员、中国抗癌协会青年委员等学术职务。

细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）是一种由细胞分泌的磷脂双层囊泡小体，其携带的特征性蛋白、核酸、脂质等生物分子往往可以作为疾病诊断的生物标志物。面对复杂样品中EV分离分析所面临的测量学难题，刘定斌教授团队以磷脂膜识别和功能化为特色，围绕EV的分离富集与检测展开研究，近年来取得代表性成果概览如下：

（一）提出了基于磷脂膜识别的EV分离新思想，建立了一套高效率、高纯度的通用型EV分离平台，为EV研究提供了一种全新的分离富集技术

EV所处的生物样本（如血清、尿液、唾液等）组成十分复杂，除了EV，还包含大量杂蛋白、游离核酸和代谢产物等非囊性杂质。这些杂质（特别是脂蛋白）的理化性质与小尺寸EV（又称外泌体）类似，使得常规的EV富集方法（如超速离心法和聚合物沉淀法）难以高效率、高纯度地将EV从复杂生物样本中分离出来，阻碍了后续EV标志物筛选与检测。为解决这一普遍性难题，刘定斌团队创造性地提出了基于磷脂膜识别的分离策略，实现了复杂临床样本中EV的高效率、高纯度富集，助力新型EV肿瘤标志物的发现（图1）。

图1. 基于磷脂膜识别的两种高效分离富集EV的策略。在策略一中，DSPE-PEG-Mal（）的疏水端自发插入到EV膜上，末端的Mal与磁球上的巯基发生点击化学反应，实现EV高效富集；策略二基于CP-PC高亲和力识别而富集EV，且在42℃条件下实现无损释放，无需加入额外试剂，为EV相关研究和应用提供了全新的分离富集技术。

首先，该团队采用DSPE-PEG-Mal分子作为磷脂特异性识别探针，建立了一种基于物理插入的磷脂膜修饰策略。该探针的疏水端（DSPE）自发地插入EV磷脂膜中；PEG作为连接基团；Mal（马来酰亚胺）通过点击化学高效地与含巯基的磁球结合，实现EV的快速磁性富集。该方法对血清中EV的富集效率达到60%，纯度高于80%。

为了进一步提高EV分离富集的效率和纯度，他们设计了胆碱磷酸（choline phosphate, CP）功能化水凝胶磁球（简称MB@CP），利用CP与EV膜上的磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline, PC）形成高亲和力CP-PC多价配位键，实现了不同临床样本中EV的高效率、高纯度分离富集。而其他杂质（注：临床样本中的细胞及其碎片通常已被前处理去除）由于不含有致密的PC层，不会被MB@CP捕获。重要的是，CP-PC配位键可在42℃条件下快速断裂，从而将EV从磁球上释放下来，无需加入额外试剂，保障了EV的纯度和活性。MB@CP能有效地从临床血清、尿液和唾液中分离出EV，分离效率和纯度均达到90%以上，多项性能明显优于超速离心、密度梯度离心、聚合物沉淀和免疫磁珠法等常用方法（详细性能对比见表1），为EV的基础研究和临床应用提供了一种通用性的高效分离富集平台。相关研究成果发表于Sci. Adv. 2023, 9, adf4568; Anal. Chem. 2019, 91, 13633−13638; Anal. Chem. 2019, 91, 12752−12759。

表1. 各种EV分离富集技术的性能对比

（二）设计了肿瘤微环境特异响应的膜插入肽，实现对肿瘤来源EV的选择性富集，结合组学筛选出了几个新型肿瘤EV标志物，开展了相关试剂盒研发工作，助力癌症早期筛查

生物样本中的EV来源多样，可由肿瘤组织、正常组织和血细胞等分泌。若能把肿瘤来源的EV选择性分离出来，将推动肿瘤转移和复发机制的基础研究，助力发现全新的肿瘤标志物。然而，这些来源不同的EV具有相似的尺寸和结构，用超速离心、聚合物沉淀和尺寸排阻等传统方法无法分离。近年来，一些基于肿瘤EV膜蛋白免疫识别的新兴分离平台展现出了良好的特异性，但由于EV膜蛋白表达具有很强的异质性，导致其分离效果较差。因此，发展具有肿瘤EV特异性的高效分离富集方法是该领域悬而未决的难题。

刘定斌团队开发了一种从血清中选择性分离富集肿瘤微环境来源EV（circulating tumor microenvironment-derived extracellular vesicle, cTME-EV）的技术平台。这一成果以直接投稿的方式（direct submission）发表在《美国科学院院刊》（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2023, 120, e2214912120）上。该平台的技术核心是一种自主设计的双开关pH响应肽（简称D-S pHLIP），其在肿瘤弱酸性微环境（pH 6.2-6.8）中发生质子化，由亲水性的去折叠态变为疏水性的螺旋结构，从而通过疏水相互作用插入cTME-EV膜上；该螺旋结构进一步发生二次折叠，形成钩状结构，使其在体循环（pH 7.4）中依然牢牢锚定在cTME-EV中（图2A,B）。通过在D-S pHLIP的N端引入生物素（biotin），其与链霉亲和素修饰的磁球（简称MB@SA）高效识别，选择性地从血清中分离富集出cTME-EV。

刘定斌团队以肺癌和乳腺癌为研究对象，从模型小鼠血清中分离出cTME-EV进行肿瘤标志物筛选研究。超速离心法（ultracentrifugation, UC）是分离EV最常用的方法，被用于对照。刘定斌团队从D-S pHLIP组中鉴定出6256个差异基因，其中包含一些显著上调的hub基因（如Alb和Kng1）（图2C），可用作潜在的肿瘤标志物；而在UC组中仅发现332个差异基因，且没有筛选到和肿瘤相关的hub基因（图2D）。这一结果表明，通过选择性富集肿瘤来源EV，有助于筛选到全新的肿瘤标志物。

图2. D-S pHLIP平台用于cTME-EV的选择性分离富集及下游肿瘤标志物筛选。（A）D-S pHLIP的设计；（B）Biotin修饰的D-S pHLIP（Biotin-D-S pHLIP）用于cTME-EV选择性分离富集及其转录学研究示意图。Biotin-D-S pHLIP在体循环中（pH 7.4）处于去折叠态；进入肿瘤微环境（TME, pH 6.2-6.8）后，Biotin-D-S pHLIP变为螺旋结构，通过（i）直接插入EV和（ii）先插入细胞膜再排出EV两种模式成功修饰到cTME-EV上，再代谢到体循环中。结合磁分离技术将cTME-EV选择性富集，进行后续转录组学研究。（C）D-S pHLIP组和作为对照的UC组（D）的转录组学火山图结果及其所鉴定出的前十位hub基因。

基于上述高效EV分离富集和筛选技术，刘定斌团队利用大量临床实际样本开展了肿瘤EV标志物鉴定研究，首次发现了粪便中的EV（faecal EV, fEV）可作为结直肠癌无创诊断和预后的标志物。他们鉴定出两个表达在fEV上的结直肠癌标志物——CD147和A33，其对结直肠癌的诊断敏感性可达到89%，远远高于目前临床使用的CEA（40%）（图3），且可用于结直肠癌的预后评估。由于粪便与肠道有着特殊关联性，fEVs携带了结直肠肿瘤特异的生物信息，其通过粪便排出体外，为结直肠癌的无创诊断提供了便利，具有巨大的临床应用价值。这一发现填补了fEVs与临床诊断之间的空白，将有力推动结直肠癌基础研究，助力全新结直肠癌早筛试剂盒的开发。刘定斌团队与天津市人民医院、中石化北京化工研究院达成了联合开发协议，助力该项研究的成果转化和临床推广。相关成果发表于J. Extracell. Vesicles 2023, 12, 12300; Anal. Chem. 2018, 90, 11273−11279; Anal. Chem. 2020, 92, 2103−2111。

图3. 结直肠癌患者粪便样本中EV的分离富集及其膜蛋白肿瘤标志物的鉴定与检测。

（三）建立了基于磷脂膜功能化的肿瘤EV标志物高灵敏、高通量检测新方法，为EV的临床应用奠定了基础

在临床样本中，癌症相关EV的浓度仅为10⁷-10⁸个/毫升，每个EV上的膜蛋白标志物仅为个位数，且存在较强的表达异质性，导致传统方法（如常规流式分析和酶联免疫法）难以检测。刘定斌团队围绕EV磷脂膜功能化，发展了EV膜蛋白标志物高灵敏检测方法，这些检测在临床常用的流式细胞仪和酶标仪上即可完成，无需研发新设备，有利于临床推广。

流式细胞仪作为一种细胞分析的主要工具，通常仅能检测300 nm以上的荧光标记颗粒；由于临床样本中的EV以外泌体为主，其尺寸介于30~150 nm之间，因此无法通过常规流式细胞仪进行检测。为此，刘定斌团队开展了荧光标记和检测的方法学研究，开发了系列高灵敏探针，通过调控探针与颗粒表面的亲疏水相互作用，实现对纳米级生物颗粒的选择性标记和高灵敏检测。进一步，刘定斌团队构建了基于pH响应嵌段聚合物的EV可控组装系统，通过调节体系的pH值改变EV表面的亲疏水性，可将单个纳米尺寸的EV颗粒组装为微米尺寸的EV团簇，即可实现EV膜蛋白的高灵敏检测（图4），突破了常规流式细胞仪无法直接用于小尺寸EV分析的测量学瓶颈。该检测方法简单，所需样本量较小（10 μL），无需研发新设备，具有很强的临床应用前景。相关研究成果发表于Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202204518; Nano Lett. 2021, 21, 8817–8823; ACS Nano 2019, 13, 1421–1432; Small Methods 2022, 6, 2101234。

图4.（A）pH响应嵌段聚合物的分子式及亲疏水相变机制；（B）利用pH介导小尺寸EV由纳米级单囊泡组装成微米级多囊泡聚集体，从而在常规流式细胞仪上实现小尺寸EV表面蛋白标志物检测。

EV膜蛋白高通量检测对于肿瘤标志物筛选具有重要意义。目前，酶联免疫法是蛋白高通量检测的最常用方法，但其灵敏度较低，操作繁琐。如何同时实现EV膜蛋白的高通量、高灵敏检测是该领域所面临的测量学难题。刘定斌团队以超小（2 nm）胶体金为标记单元，利用其独特的光学性质和纳米酶特性，建立了复杂样本中肿瘤标志物的高灵敏定量检测方法。通过在EV磷脂膜上包被超小尺寸胶体金，形成EV@Au复合结构，其表面的靶标膜蛋白被微孔板上负载的抗体特异性捕获。EV@Au催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色，颜色深浅与目标膜蛋白的表达水平成正比，据此实现EV膜蛋白标志物的快速筛选（图5）。相较于常用的酶联免疫法，他们所发展的方法具有以下优势：（1）灵敏度提高了一个数量级；（2）仅使用一种抗体（无需检测抗体和酶标二抗）；（3）大大简化了检测步骤。该方法的构建为EV膜蛋白标志物的高通量筛选提供了一种简单快速的测量学平台。相关研究成果发表于J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 919−928; Theranostics 2020, 10, 9303−9314。

图5. 基于胶体金纳米酶辅助的EV膜蛋白标志物高通量快速免疫检测。（A）检测示意图；（B）EV的TEM图；（C）EV标记了胶体金纳米酶的TEM及其放大图（D）。

病征晚现疗时误，囊泡早诊铺通途；

磷脂界面绘良策，磁性富集效纯足；

变构探癌无创检，巧量蛋白点踪属；

临床试样为实用，望以杏林济悬壶。

综上，刘定斌团队以复杂生物样本中肿瘤EV标志物筛选和检测为研究目标，围绕EV分离分析的关键科学问题开展化学测量学研究，取得了阶段性研究成果，具有重要的临床意义。刘定斌团队正与临床一线团队合作，旨在发现更多高效的肿瘤标志物，并发展出更加便捷的检测方法，为癌症筛查、诊断、分型和预后提供全新的液体活检平台。