清除活性氧的保护女神——谷胱甘肽过氧化物酶GPx及其含硒模拟物

硒（Selenium）元素属于氧族元素（Chalogen），在元素周期表位于第三周期第Ⅵ A族。本文主要围绕硒的有机化合物，讲述它们在生物化学、药物化学、有机化学、材料化学等的用途。

1 硒元素的发现之旅

首先，让我们来回顾一下几位19世纪早期的著名化学家，在感叹他们的高超技术和细致观察的同时，也希望能传承他们的探索精神。

1.1 发现

硒的发现与瑞典化学家Jöns Jakob Berzelius息息相关，他是十九世纪上半叶最著名的化学家之一，现代化学命名体系的建立者，元素硅、硒、钍和铈元素的发现者，他的光辉贡献大家可以自行度娘。19世纪初，德国化学家M. H. Klaproth（元素钛、铀、锆的发现者）曾在瑞典和Berzelius共事，研究硫酸厂煅烧黄铜矿的铅室残渣。这种残渣具有不一般的性质，散发着烂萝卜般让人不快的味道，并且与之接触的皮肤会被腐蚀起泡。Klaproth根据他之前发现碲元素的经验认为沉残渣中含碲，但Berzelius并不认可这一观点。在和另一位瑞典化学家J. G. Gahn（元素镁的发现者）合作后，Berzelius重新研究了这种残渣，他向法国化学家Claude-Louis Berthollet写信解释道：”残渣中并没有任何碲的迹象，但是这种未知物质的性质与碲很类似，基于这种原因，据碲希腊语为地球的意思，我把她取名为硒Selenium，取自希腊语中月之女神Selēnē，以与碲（Tellurium）遥相呼应”。随后，将其发表在法语期刊Annales de Chimie et de Physique（1818）上，这是硒的第1篇科研论文，由此正式拉开了硒化学的大幕。也许令Berzelius意想不到，他的这一命名，冥冥之中硒的命运就像月球一样带有两面性，伴随着光明与阴暗，有益和有害。[1]

1.2 抛弃

硒化学，特别是有机硒化学的发展是缓慢的，甚至还曾被社会抛弃。究其原因主要有三。一是毒性，早期硒被认为是绝对的毒性物质，特别是对畜牧业。在含硒量较高的地方中，由于牧草的富硒作用，会引起牛羊等动物硒中毒，造成跛行和脱毛脱蹄等。13世纪的马可波罗在他的游记中曾记载过中国西部肃州毒草引起牲畜中毒。除毒性外，第二个制约因素是硒化合物的不稳定性，Berzelius曾预言，C-Se键不如C-S键稳定，Se-Se键也没有S-S键稳定。尽管第一个合成的有机硒化合物二乙基硒醚于1836年制备，1847年由Wöhler（开辟了有机化学，首次人工合成尿素，亦曾在Berzelius门下进修过）和Siemens公开发表，但纯化困难、衍生物不稳定等因素使这个化合物的纯化与鉴定却拖延到1869年。[2]

然而，真正制约有机硒发展的不是技术上的难题，而是臭味，它实在太~臭~啦~！！！硫化物已经臭名昭著了，硒化物有过之而无不及。Berzelius的管家曾抱怨过他的口臭，Wöhler用“地狱和恶魔”来形容乙硒醇的味道，这也使化学家在踏入硒的领地时望而却步。即使化学家为了研究可以尽量忍受，但他的家庭、同事却是零容忍。据说Frost教授在剑桥大学就有过一段悲催的经历，由于他合成的化合物散发的味道使同实验室的同事无法忍受，他被“请”到通风最好的楼顶做实验，然而没想到的是，恶臭弥漫到了整个校园，甚至打断了正在举行的达尔文纪念大会。结果，Frost教授和他的化合物被驱逐出剑桥的校园。笔者也曾做过硒化合物，笔者的导师曾意味深长的说：“你做实验我放心，在你中毒之前，早就被臭跑了”。~囧~

1.3 觉醒

如同苦难的人终究会站起来，硒在长期不受待见后，在二十世纪中期得到转机。1950s末期，Schwartz和Foltz首次确定了因子3在鸡、鼠等动物中可代替维生素E保护肝脏，其中硒是个关键成分。这个里程碑式的发现，使硒摆脱了有毒的名声，原来硒在维护健康方面也有积极和重要的作用。到了1970s年代，硒研究又向前迈了一大步，Rotruck发现硒是谷胱甘肽过氧化物酶（一种保护细胞过氧化的抗氧化剂）的关键组分，随后Flohé进一步指出GPx是个四聚物，其核心部位是硒半胱氨酸（被称为第21种氨基酸），并且每摩尔约含4g硒，由此硒开始彻底翻身。硒化学家们在论文的开题不用再说硒是一种恶臭有毒的物质，而以她是易氧化和必需的微量元素来代替。

与此同时，在有机化学领域中，硒亚砜消除β氢生成碳碳双键的反应成为重要的有机合成方法，使得硒在合成中的应用越来越多，如二苯二硒醚、苯硒溴等成为商业化的试剂。这一系列重要发现使硒“守得云开见月明”，从阴暗走向光明。1971年，国际硒碲化学会（ICCST， International Conference on the Chemistry of Selenium and Tellurium）成立，约三年一度的大会，使世界各地的化学家一起交流，促进了硒化学的研究。硒化学逐渐走向公众视野，硒的生物化学、有机化学、药物化学、植物富硒作用等研究论文开始繁荣起来。

2 正题

在简单了解硒的历史后，让我们言归正传，谈一谈这种神奇的元素凭其自身特点发挥着什么作用。先从打赢翻身仗的硒酶GPx开始吧，清除活性氧的保护女神——谷胱甘肽过氧化物酶GPx及其含硒模拟物。

硒酶是一类活性位点上是硒半胱氨酸selenocysteine（Sec, U）的一类蛋白。由于硒原子特殊的氧化还原性质，这类酶在维持细胞内正常的氧化还原平衡或者调控甲状腺激素含量中起到主要作用。到目前为止大概发现了30种硒酶，但仅有少数被分析纯化表征，如脱氢酶dehydrogenases、氢化酶hydrogenases、甘氨酸还原酶glycine reductase、甲状腺素脱碘酶iodothyronine deiodinases（ID）、硫氧还蛋白还原酶thioredoxin reductases（TrxR）、硒磷酸酯合成酶selenophosphate synthetase和谷胱甘肽过氧化物酶glutathione peroxidase（GPx）等^[3]。但截至目前，也只有GPx被深入和广泛的研究。

2.1 谷胱甘肽过氧化物酶的作用和结构特点

GPx是一种哺乳动物中的抗氧化酶，其主要作用是在谷胱甘肽或其他硫醇的共同作用下，清除活性氧族（Reactive Oxygen Species，ROS），具有清除过氧化氢、脂及磷脂自由基，保护膜结构，保护脂蛋白、DNA等生物大分子，参与炎症调节等作用。活性氧是代谢过程中的副产物或者外界刺激下产生的，主要包括超氧自由基（O₂^-）、过氧化氢（H₂O₂）、氢氧自由基（•OH）、单线态分子氧、过氧化脂类等，依赖于各种抗氧化系统的氧化还原平衡，ROS在正常细胞中可以保持在一定水平。ROS可以调节各种细胞行为，但一旦细胞内的ROS平衡被打破，将引发严重的后果，例如神经元退化、癌症、糖尿病、衰老、脂肪过氧化紊乱或者活体细胞被氧化破坏等等。得益于硒在人体中的重要作用，硒从一种有毒物质，转变为一种必需的微量元素，世界卫生组织（WHO）推荐成人的日摄取量为70 μg/天。

从结构上看，在GPx催化活性中心中的色氨酸（Trp158）和谷氨酰胺（Gln80）中的氮原子在氧化还原过程中稳定了硒半胱氨酸中的硒原子，如图1所示，并且这种弱键作用在催化循环中起到重要作用^[4,5]。

图1. GPx及活性中心结构示意图

典型的GPx催化循环模型如图2所示，以过氧化氢作氧化剂为例，过氧化氢与硒半胱氨酸中的硒醇部分 (Enz-SeH)1反应，生成次硒酸(Enz-SeOH)2，次硒酸2与细胞内的硫醇如GSH反应，首先生成硒硫化物(Enz-Se-SG)3后，再与第二个硫醇分子反应，使硒-硫键断裂，硒醇1重生。在硒-硫键断裂的同时，得到一当量的二硫醚GSSG，后者在NADPH依赖型的谷胱甘肽还原酶(GR)作用下重生，维持细胞内的GSH含量。大量的ROS可以生成亚硒酸(Enz-SeO₂H)，在GSH还原下是可逆的反应，但再过量的ROS生成的硒酸(Enz-SeO₃H)将使GPx酶失效^[6]。

图2. GPx可能的催化机理

2.2 有机硒化合物作为GPx模拟物

2.2.1 Ebselen的结构特点和毒性产生原因

根据硒原子的性质特点，化学家合成了一些小分子的有机硒化合物，来模拟GPx的作用，第一个合成出来的化合物是ebselen (2-phenyl-1,2-benzisoselenazole-3)-(2H)-one，具有异硒唑杂环结构，中文名为依布硒啉。Ebselen不论在体内还是体外，都表现出很好的生物活性，并在听力损伤、炎症、中风、神经系统退化、再灌注损伤等适应症进行三期临床试验，甚至可以表现出锂离子的作用治疗抑郁狂躁型忧郁症^[7]。但ebselen并不是完美的GPx模拟酶，在对ebselen及其衍生物的深入研究中发现，在ebselen存在硒-氧非键作用，这种作用在与GSH反应中，断裂Se-N键生成硒硫化物的过程中，以及对硒硫化物的稳定性起到了积极作用，但这种非键作用又阻止了硒醇的重生，弱化了GPx活性[8]。

图3. Ebselen中的硒-氧非键作用

最近发现Ebselen的毒性源自于它抑制了谷胱甘肽还原酶glutathione reductase（GR），而GR主要是将GSSG重生为GSH，因此细胞内的GSH逐渐消耗殆尽，产生毒性。GR酶中半胱氨酸（cys58和cys63）残基中的硫醇和ebselen反应，生成了稳定的硒硫化物，可通过MALDI-TOF质谱确认^[9]。尽管如此，Ebselen仍然是重要的先导化合物，作为其他硒化合物GPx模拟酶的标杆。

图4. 谷胱甘肽还原酶GR和ebselen的反应

2.2.2 其他有机硒化合物

由于GPx中，硒原子和周围氨基酸中的氮原子存在相互作用，人工合成的小分子GPx模拟物大部分含有杂原子结构，这些化合物的结构多种多样^[4,5,10-14]，充分显示了化学家的创造性，如图5所示，甚至一些树枝状二硒醚分子^[15]、环糊精类二硒醚^[16]，也具有很高的GPx活性。

小分子有机硒化合物模拟酶，可根据结构分为两大类：（1）硒直接和杂原子相连接，（2）杂原子在硒原子附近，存在较弱的硒-杂原子非共价键相互作用。但其结构中由于硒原子附近的电子和空间位阻不同，催化机理也不相同，又因为ROS的种类和硫醇不同而异，但总体和GPx催化循环类似^[5]。近来，圣卡塔琳娜联邦大学Antonio L. Braga等，则提出了另外的观点，硒醚类化合物的GPx能力，主要是硒亚砜在起催化作用，机理如图6所示^[17]。

图5. 小分子有机硒化合物作为GPx模拟物

图6. 硒醚类化合物模拟GPx的可能机理

值得关注的是，最近印度科技学院G. Mugesh（有机硒化合物作为GPx模拟物的重要课题组）等综合考虑了GPx模拟酶的结构特点和催化原理，合成了异硒唑类化合物30，在合成过程中二硒醚29自动成环得到杂环化合物30，合成路线如图7所示^[9]。这类化合物巧妙的保留了硒与杂原子直接相连，便于与GSH反应，又存在与相邻杂原子的硒氧非键作用，以稳定极化的硒原子。由于少了酰胺中的羰基，两者间的Se-N键不同，催化机理也发生了改变，在H₂O₂作为氧化剂下，化合物30历经了硒亚砜、硒醇、次硒酸的循环。

图7. 含硒杂环化合物30的合成

图8. 化合物30可能的催化机理

生物活性研究发现，化合物30的GPx活性是ebselen的两倍多，除此之外还兼具保护细胞的作用。Ebselen可以保护约70%的DNA，它则保护了95%以上的DNA免受过氧化氢的氧化，DCFDA荧光探针可以清楚监测它清除过氧化氢引发的ROS。药理研究还发现化合物30在细胞内的GSH或Trx的辅助下，保护细胞免受氧化剂的损害，并不是靠调节内在的氧化应激信号Nrf2，而是靠补充抗氧化系统能力起作用。硒虽然是必须的微量元素，但绝不能因此忽略了它的毒性，含硒化合物作为抗氧化物开发时，它的毒性也是重要的关注内容，幸运的是化合物30的毒性要比ebselen低几倍，可以作为一种潜在的抵抗氧化应激的药物。

3. 展望

有机硒化合物除可以作为GPx模拟酶外，在药物化学中，还可作为抗肿瘤药物、抗甲状腺药物，修复受损DNA等众多应用。虽然有机硒化合物作为GPx模拟酶已经引起了化学家的兴趣，但它的机理还在深入研究过程中，新的化学结构也在不断合成，如何得到具有高效低毒的GPx模拟酶，保护人类免受极端环境下产生氧化应激的副作用，或治疗氧化应激引起的疾病，仍然任重而道远。

参考文献

[1] Selenium in Food and Health, Ed.: Conor Reilly, Springer, 2006.

[2] Organoselenium Chemistry, Ed.: Thomas Wirth, Wiley-VCH, 2011.

[3] Lancet, 2000, 356, 233-241.

[4] Acc. Chem. Res., 2010, 43, 1408-1419.

[5] Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 10262-10272.

[6] Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54, 10074-10076.

[7] Nat. Commun., 2013, 4, 1332.

[8] Chem. Eur. J., 2015, 21, 6793-6800.

[9] Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54, 8449-8453.

[10] Chem. Rev., 2001, 101, 2125-2179.

[11] J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 12104-12105.

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[13] J. Org. Chem., 2015, 80, 5633-5642.

[14] J. Org. Chem., 2015, 80, 7385-7395.

[15] J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 10556-10557.

[16] J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 16395-16404.

[17] J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 138-141.