Cell发布中国克隆猴重大成果，季维智院士、高绍荣教授独家点评

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克隆猴“Hua Hua”

今年离“多莉羊”问世已经21年有余了，这期间有超过20种哺乳动物通过体细胞核移植技术（Somatic Cell Nuclear Transfer，简称“SCNT”）手段实现克隆。然而，通过SCNT技术实现非人灵长类动物克隆，却因为困难重重，长久以来都未能实现。不过，难并不意味着不可能，在激烈的竞争环境下，中国科学家率先完成了体细胞克隆猴这一历史性突破。

1月25日，由中科院上海神经科学研究所孙强、蒲慕明领导的研究团队在Cell杂志发布了题为“Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer”的重要成果，在世界范围内首次利用体细胞核移植技术完成了克隆猴。鉴于该成果具有重大历史意义，BioArt特别邀请到了灵长类动物研究专家、中科院院士季维智教授和干细胞重编程领域杰出学者、同济大学生命科学与技术学院院长高绍荣教授（“多莉羊”之父Ian Wilmut爵士曾经的博后）作点评和解读，以飨读者！

在这项研究中，研究人员使用猴胎儿成纤维细胞，通过体细胞核移植技术获得了两只健康的食蟹猴（cynomolgus monkeys，Macaca fascicularis），两只猴分别被命名为“Zhong Zhong”和“Hua Hua”，合起来就是“Zhong Hua（中华）”。组照及视频如下：

自1997年克隆羊“多莉”问世以来，20余年间，科学家利用体细胞核移植技术对20余种动物（包括小鼠、狗、牛、兔、骡子、马、鹿等）相继成功实现克隆。详见列表：

通过核移植克隆成功的哺乳动物。图片内容引自：Rodriguez-Osorio, N., Urrego, R., Cibelli, J. B., Eilertsen, K., & Memili, E. (2012). Reprogramming mammalian somatic cells.Theriogenology, 78(9), 1869-1886.

多莉羊之父 Ian Wilmut 爵士与 Dolly。Dolly 生于1997年，存活6年之后，因关节炎于2003年被安乐死。图片来源：The Roslin Institute, Creative Commons 2.0

谈到克隆猴，不得不提及来自美国俄勒冈灵长类动物研究中心的两项代表性工作。事实上，早在1997年，东北农业大学的校友孟励博士就作为第一作者在Biology of Reproduction杂志上报道了通过卵裂球核移植技术获得的第一只克隆猕猴【1】；2000年，俄勒冈灵长类动物研究中心的另一个小组在Science杂志上发文，报道他们采用胚胎分裂法（embryo splitting）克隆了猕猴Tetra【2】。这种克隆方法不同于科学家们常用的成体细胞核移植技术，而是把多个猴胚胎（107个）进行分裂，然后对胚胎进行移植，结果有4个能够发育，最终只有Tetra在胚胎分裂157天之后幸运地降生【2】（见下图）。值得说明的是，上述克隆方法并没有得到学术界较大关注，因为它与一般意义上的体细胞克隆技术（SCNT）有较大差别，技术难度也不在一个层次。

第一只克隆猕猴Tetra。图片引自：Chan, A. W. S., Dominko, T., Luetjens, C. M., Neuber, E., Martinovich, C., Hewitson, L., ... & Schatten, G. P. (2000). Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting. Science, 287(5451), 317-319.

那么，为什么通过SCNT手段克隆猴会非常困难呢？难点主要在于核移植后胚胎存活率低，胎儿容易流产。过去多个国际科研团队在进行体细胞克隆猴的过程中无一例外失败了【3-7】。

另一个难点在于，为了克服体细胞重编程过程中的很多表观遗传修饰障碍，需要对SCNT技术进行优化。孙强小组获得成功一方面得益于他们娴熟的技术操作，另一方面——从技术上讲——离不开近年来科学家们对克隆胚胎重编程机制的研究，特别是近年来由哈佛大学张毅教授与同济大学高绍荣教授带领团队所做的研究。他们发现了体细胞克隆胚胎发育的主要障碍——克隆胚胎基因组上大量H3K9三甲基化的存在【8,9】。因此，孙强团队在克隆猴的过程中注射了H3K9me3甲基化去甲基化酶KDM4d，并同时使用了此前科学家在其它哺乳动物中使用的HDAC（组蛋白去乙酰化酶）抑制剂TSA（Trichostatin A）【10】（该重要成果发表在BBRC杂志上，被引超过500次），大大优化了克隆方法，最终获得成功。

最后梳理一下这篇Cell论文中的细节。在这篇论文中，研究人员采用SCNT技术尝试了两种供体细胞。一种是猴胎儿成纤维细胞，另一种是猴卵丘细胞（位于卵丘的卵泡细胞）。“Zhong Zhong”和“Hua Hua”正是来源于胎儿成纤维细胞的克隆，而通过卵丘细胞最终获得的克隆猴出生不久就死亡了。

利用猴胎儿成纤维细胞的SCNT中，研究人员将获得的79个克隆胚胎（处于2细胞至囊胚期）移植入21只代孕母猴中，最终有6只代孕母猴成功怀孕，共携带5个胎儿（有一个怀孕的是双胞胎），另外两只仅携带了孕囊（gestational sacs）。4只代孕成功的母猴有两只流产，剩下两只正常怀孕超过140天，然后通过剖腹产手段获得两只存活的猴“Zhong Zhong”和“Hua Hua”。据论文描述，两只存活下来的克隆猴在论文修改后重新提交时已经分别人工饲养了50天和40天（The newborn baby monkeys, named Zhong Zhong (ZZ) and Hua Hua (HH) , survived in good conditions under human feeding and care for 50 and 40 days, respectively, at the time of manuscript resubmission.）。

利用猴卵丘细胞的SCNT中，最终有两只胎儿发育超过了130天，通过剖腹产手术出生后不久就死亡了（分别在出生3小时和30小时后死亡）。

总的来说，通过成体细胞核移植技术获得克隆猴的成功是世界范围内的一件大事，中国科学家这次拔得头筹着实不易。研究人员想必经历了许多次失败，经过了许多方法的改进，才最终获得成功。

可以想象，体细胞克隆猴的成功意味着今后可以获取大批量相同遗传背景的克隆猴，用于某些疾病模型的建立以及药物筛选，最终为人类健康做出贡献。该研究意义重大，为中国科学家的率先突破点赞！

季维智（中科院院士，昆明理工大学特聘教授、灵长类转化医学研究院院长，云南中科灵长类生物医学重点实验室理事长）

Comments：1996年克隆羊多莉的诞生，颠覆了人们对生殖发育经典理论的认识：终端分化细胞在一定条件下可以通过重编程逆转到初始化的多能干细胞状态。这一成功的科学事件为生殖发育的基本理论和实践，如干细胞领域的发展，特别是诱导性多能干细胞（iPS）奠定了基础。20余年来，尽管多种哺乳动物体细胞核移植相继获得了成功，然而有关灵长类体细胞核移植的研究似乎并不顺利。国内外多个实验室曾经努力开展相关研究，但均未成功获得活体克隆猴。

2006年日本RIKEN的Wakayama团队发现TSA能提高小鼠克隆效率【10】；2007年，中科院昆明动物所季维智和中科院动物所周琪团队合作研究发现，猕猴体细胞核移植胚胎在2细胞和8细胞阶段DNA甲基化水平显著高于IVF胚胎； 2014年美国哈佛医学院的张毅实验室发现Kdm4d提高了体细胞核移植的效率，2016年上海同济大学的高绍荣团队发现联合使用Kdm4b和Kdm5b能极大提高小鼠克隆胚胎的囊胚率及出生率【8,9】。这些研究揭示了胚胎早期组蛋白修饰对胚胎发育至关重要，去乙酰化酶抑制剂TSA和组蛋白去甲基化酶KDM家族能有效提高克隆胚胎的囊胚发育率；如今，中国科学院神经科学研究所孙强、蒲慕明团队在食蟹猴体细胞核移植体系中找到了TSA和Kdm4d的理想浓度组合，并利用卵丘颗粒细胞和成纤维细胞为供体做了大量的实验，获得了活体克隆猴，终于实现了一个最重要物种的克隆。

灵长类动物是和人类最相似的实验动物，在研究人类生殖发育和疾病中有重要意义。本研究是继2014年获得基因编辑猴之后的又一具有重大意义的进展。可以预见，未来基因编辑和体细胞核移植技术相结合在灵长类动物上的应用，必将推动和促进生殖发育基础理论、疾病机制的研究和再生医学研究的发展。值得一提的是，近年来中国科学家在灵长类动物模型研究方面取得了一系列重大突破，说明我国在该领域已处于世界领先水平。

高绍荣（同济大学生命科学与技术学院教授、院长，转化医学高等研究院副院长，国家“杰青”，长江学者）

Comments：《体细胞克隆领域的重大突破》

1997年初，哺乳动物体细胞克隆领域取得重大突破，英国科学家伊恩·威尔穆特（我的博士后导师）等在Nature发表论文报道了利用成年羊体细胞通过核移植技术获得了克隆羊多莉（多莉羊实际上是在1996年7月出生），这一突破性研究成果当时引起了科学界和各大新闻媒体的广泛关注。接下来几年多种动物被成功克隆，体细胞克隆也连续几年入选年度十大进展。之后利用体细胞克隆胚胎建立核移植胚胎干细胞也在多种动物（包括小鼠、猴和人）成功实现，使治疗性克隆成为可能。

尽管非人灵长类体细胞克隆近年来取得了不少进展（包括成功建立猴核移植胚胎干细胞系），但是能否获得体细胞克隆猴还不清楚。可喜的是，克隆羊21年后中科院神经所孙强研究员带领的团队经过长期的努力成功获得了体细胞克隆猴，这一成果的获得离不开科学家们长期以来对克隆胚胎重编程机制的研究，特别是近年来张毅教授团队和我带领的团队发现体细胞克隆胚胎发育的主要障碍之一是克隆胚胎基因组上大量H3K9三甲基化的存在，通过在克隆胚胎过表达H3K9三甲基化的去甲基化酶可以极大提高克隆胚胎的发育[7,8]。

在克隆猴的工作中，孙强等利用过表达去甲基化酶也极大提高了猴克隆胚胎的体外和体内发育，并最终获得了来自于胎儿成纤维细胞的克隆猴。虽然他们也得到了成年猴体细胞的克隆动物，但是克隆动物出生后不久就死掉了。这也反映了现在的克隆技术还远远不是完美，还需要我们进一步去进行重编程机制的探索。另一方面也提醒某些科学家们伦理和现在的技术限制都不允许进行克隆人的尝试。

附：中国科学家的克隆研究之旅（大事记）

上世纪60年代，童第周先生率先在国内开展鱼类核移植研究。童第周等在1963年出版的《科学通报》上发表题为《鱼类细胞核移植》的论文（英文论文发表于1965年的《科学通报》）。童第周先生于1979年3月逝世，由他撰写的论文《鲤鱼细胞核和鲫鱼细胞质配合而成的核质杂种鱼》，以中英文发表在1980年的《中国科学》上，论文报道了中国成功获得具有“发育全能性”克隆鱼的成果。这是世界上报道的第一例发育成熟的异种间的胚胎细胞克隆动物；

1990年，西北农业大学（现为西北农林科技大学）张涌成培育出了胚胎克隆山羊；

1992年，江苏省农科院获得胚胎细胞克隆兔；

1995年，广西农大石德顺等与华南师大合作获得胚胎细胞克隆牛；

1999年前后，扬州大学与中科院遗传发育所合作完成体细胞克隆羊“淼淼”；

2002年，中科院动物所陈大元研究员与山东中大动物胚胎工程中心合作成功获得了一批成体细胞克隆牛；

2005年，中国农业大学李宁院士领导完成成体细胞克隆猪......

参考文献：

1、Meng, L., Ely, J. J., Stouffer, R. L., & Wolf, D. P. (1997). Rhesus monkeys produced by nuclear transfer.Biology of reproduction, 57(2), 454-459.

2、Chan, A. W. S., Dominko, T., Luetjens, C. M., Neuber, E., Martinovich, C., Hewitson, L., ... & Schatten, G. P. (2000). Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting. Science, 287(5451), 317-319.

3、Mitalipov, S. M., Yeoman, R. R., Nusser, K. D., & Wolf, D. P. (2002). Rhesus monkey embryos produced by nuclear transfer from embryonic blastomeres or somatic cells. Biology of reproduction, 66(5), 1367-1373.

4、Simerly, C., Dominko, T., Navara, C., Payne, C., Capuano, S., Gosman, G., ... & Hewitson, L. (2003). Molecular correlates of primate nuclear transfer failures. Science, 300(5617), 297-297.

5、Ng, S. C., Chen, N., Yip, W. Y., Liow, S. L., Tong, G. Q., Martelli, B., ... & Martelli, P. (2004). The first cell cycle after transfer of somatic cell nuclei in a non-human primate. Development, 131(10), 2475-2484.

6、Mitalipov, S. M., Zhou, Q., Byrne, J. A., Ji, W. Z., Norgren, R. B., & Wolf, D. P. (2007). Reprogramming following somatic cell nuclear transfer in primates is dependent upon nuclear remodeling. Human Reproduction, 22(8), 2232-2242.

7、Sparman, M. L., Tachibana, M., & Mitalipov, S. M. (2010). Cloning of non-human primates: the road “less traveled by”. The International journal of developmental biology, 54(11-12), 1671.

8、Matoba, S., Liu, Y., Lu, F., Iwabuchi, K. A., Shen, L., Inoue, A., & Zhang, Y. (2014). Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell, 159(4), 884-895.

9、Liu, W., Liu, X., Wang, C., Gao, Y., Gao, R., Kou, X., ... & Gao, S. (2016). Identification of key factors conquering developmental arrest of somatic cell cloned embryos by combining embryo biopsy and single-cell sequencing. Cell discovery, 2, 16010.

10、Kishigami, S., Mizutani, E., Ohta, H., Hikichi, T., Van Thuan, N., Wakayama, S., ... & Wakayama, T. (2006). Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.Biochemical and biophysical research communications, 340(1), 183-189.