“他山之石，可以攻玉”——一种新颖的富集鉴定内源性SUMO化修饰的方法

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SUMO化修饰（smallubiquitin-like modifier）顾名思义是一种与泛素化修饰相似的对靶蛋白的共价修饰。人源的SUMO家族共有四个成员：SUMO1，SUMO2/3和SUMO4。与泛素蛋白修饰靶蛋白的方式相同，SUMO蛋白的C末端（从两个甘氨酸开始）与靶蛋白上的赖氨酸残基的游离氨基进行共价连接，从而调节靶蛋白的功能。另一方面，与泛素化修饰不同的是，SUMO化修饰的靶蛋白通常是低丰度蛋白，而且SUMO化本身的相对丰度也很低。因此，科研人员不得不引入外源性SUMO蛋白，并利用His tag以利于富集和提高检测特异性。

比较有代表性的一种方法是2014年由荷兰莱顿大学Alfred Vertegaal教授实验室和德国马普所的Matthias Mann教授实验室共同开发的引入外源性SUMO蛋白的突变体来对SUMO化修饰的蛋白/多肽进行富集鉴定的方法【1】。该方法需要引入外源性His10-SUMO3-K0-Q87R，即：需要对SUMO3蛋白的N末端加上His tag，突变掉SUMO3上所有的赖氨酸，以及将87位谷氨酰胺突变为精氨酸；然后对细胞总蛋白进行IMAC富集His tag-SUMO3修饰蛋白；再进行Lys-C酶切，对得到的多肽进行第二轮IMAC富集得到His tag-SUMO3修饰多肽；再进行trypsin酶切得到带有SUMO3残基（QQTGG）的多肽；导入质谱进行分析和鉴定。通过这种方法，作者得到超过7千个SUMO化位点，鉴定到SUMO修饰的靶蛋白超过3600种。尽管这实验设计非常巧妙，但由于研究引入了外源SUMO，所得到结论是否可以反映生物体内真实现象则需打一个问号。另外，此方法的操作流程非常繁琐：构建突变体质粒、转染、两步富集、两步酶切等。而且由于最终SUMO化修饰的多肽上带有5个氨基酸的SUMO残基导致的质谱数据分析也更为复杂，进而会限制此种方法在一般的实验室广泛应用。最后，由于要引入外源性的SUMO蛋白，此种方法被局限于细胞样品，无法在动物组织样品和临床样品中操作。

针对目前大规模SUMO化富集鉴定的困难，美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员和CST的科学家共同开发了一种有效并且简便的富集内源性SUMO化修饰多肽的方法，其成果发表在近期的Nature Communications上【2】）。在这项工作中，作者借鉴了目前非常流行的对泛素化修饰的多肽进行富集的高效方法：即利用经泛素化修饰的蛋白被trypsin酶切后会在修饰的赖氨酸上产生两个甘氨酸的残基（~KGG），再使用CST开发的针对泛素残基KGG特异性富集的PTMScan试剂盒进行高效富集，并进一步进行质谱分析。但是，泛素化之所以可以用这种方法进行富集是因为其C末端的两个甘氨酸前面是一个精氨酸（R），但是SUMO化所有四个家族成员的C末端的两个甘氨酸前面都是苏氨酸（T），如果还是采用最常见的trypsin进行酶切就无法得到带有KGG残基的SUMO化修饰的多肽（图1a）。

这样看来，若要进行SUMO化蛋白的富集，关键就是找到另外一种蛋白酶可以对苏氨酸的C末端进行有效切割，进而就可以将SUMO化修饰的蛋白切割成SUMO修饰位点带有KGG的多肽从而利用KGG残基试剂盒进行富集和后续的质谱鉴定。UCSD的研究人员于2014年成功从Lysobacter enzymogenesis中分离、鉴定得到一种名为WaLP的蛋白酶，可以很好地满足上述要求【3】。依据大规模蛋白质组学数据的分析结果，WaLP对于A，T，S和V这四种氨基酸的C末端有非常高的酶切倾向性；并且WaLP对于碱性氨基酸H，K和R的相对酶切能力几乎为零。这是一项对于SUMO化修饰富集非常重要的特性，因为只有这种蛋白酶对苏氨酸的C末端而不是精氨酸的C末端有选择性的酶切倾向时，我们富集到的带有KGG残基的肽段才会是来自于SUMO化修饰而不是泛素化修饰。同时，作者证明使用WaLP酶切得到的多肽长度和疏水性分布也比较适合以C18反向色谱分离和质谱分析鉴定。因此，UCSD的研究人员和CST的科学家决定联合开发WaLP酶切结合KGG多肽富集的方法来鉴定内源性SUMO修饰位点，其流程如图1C所示。

图1:（a）泛素和SUMO蛋白结合靶蛋白的C末端氨基酸比较；利用高特异性的KGG残基抗体试剂盒对泛素化修饰位点肽段（b）和SUMO化修饰位点肽段（c）进行富集分析的流程示意图。其中的关键区别是使用不同的蛋白酶处理样品：分析泛素修饰使用trypsin；分析SUMO修饰使用WaLP。

此项工作使用Hela细胞（heat shock处理）和HCT116细胞（SILAC培养+蛋白酶体抑制剂MG-132处理）来确定本方法对不同定量方法（非标记定量和SILAC）的匹配。作者从两种细胞样品中一共鉴定到1209个内源性SUMO修饰位点，与引文【2】中报道的数据相比（即引入外源性突变SUMO蛋白），只有约三分之一的位点之前被鉴定到（图2a），证明了此方法的独特性。如果仔细观察鉴定到的KGG肽段（图2b，c）我们可以看到这两条肽段都有赖氨酸，证明WaLP对于碱性氨基酸确实有非常弱的切割活性。

图2：（a）本次工作报道的内源性SUMO化位点和之前的工作（即引入外源性突变SUMO蛋白）所鉴定到的SUMO化位点比较。（b, c）CID二级质谱谱图支持鉴定到的SUMO化位点。

虽然WaLP在之前的研究中已经被证实对于精氨酸的C末端基本没有酶切活性【3】，在此项工作中，实验人员依然设计了严密的验证实验来确定鉴定到的带有KGG残基的肽段确实是来自于SUMO化修饰，而不是泛素化修饰。文章作者利用泛素化蛋白酶Usp2cc和SUMO化蛋白酶SENP1/2（特异性移除靶蛋白上的泛素化和SUMO化修饰，而不会对靶蛋白本身进行酶切）对Hela细胞总蛋白进行处理，经由western blots验证得到只存在泛素化或只存在SUMO化修饰的样品，分成相同的两份分别进行trypsin酶切和WaLP酶切，以及KGG肽段亲和富集。通过定量分析鉴定到的带有KGG残基的肽段在未处理和处理过的Hela样品中的相对丰度变化，就可以确定富集结果的特异性（图3）。这里的逻辑是：如果WaLP酶切针对SUMO化特异性好，则用SENP预处理会明显降低WaLP酶切样品的SUMO化检出数量；而用trypsin则不会对SENP的处理起明显反应。反之亦然。在图3 b-c中，我们观察到了完全符合预期的实验现象，从而验证了利用WaLP酶切，KGG残基抗体富集鉴定SUMO化修饰位点的特异性。

图3：（a）经由泛素化蛋白酶Usp2cc和SUMO化蛋白酶SENP1/2处理得到的Hela细胞总蛋白。Western blots（SUMO-1, SUMO-2/3, total ubiquitin）确认在实验条件下大部分内源性泛素化修饰和SUMO化修饰被相应的酶特异性移除。（b）在经由SENP1/2移除内源性SUMO化修饰的样品中，通过WaLP酶切，KGG残基抗体富集得到的KGG肽段与未处理的样品相比，绝大部分出现了相对丰度的降低【绿色条柱】；而通过trypsin酶切，KGG残基抗体富集得到的KGG肽段与未处理的样品相比，未发现相对丰度的显著变化【紫色条柱】；（c）在经由Usp2cc移除内源性泛素化修饰的样品中，通过trypsin酶切，KGG残基抗体富集得到的KGG肽段与未处理的样品相比，绝大部分出现了相对丰度的降低【紫色条柱】；而通过WaLP酶切，KGG残基抗体富集得到的KGG肽段与未处理的样品相比，未发现相对丰度的显著变化【绿色条柱】

与之前的基于引入外源性突变SUMO蛋白的方法相比，本文所报道的方法的一大优势在于可以检测内源性的SUMO化蛋白，而且检测样品类型可以拓展到组织。文章中作者对四种小鼠组织（脑、心、肝和肌肉）中的SUMO化修饰位点进行了鉴定，一共鉴定到144个内源性SUMO化位点。其中，泛素蛋白的48和63位的赖氨酸可以被SUMO修饰，说明泛素化和SUMO化修饰可能存在着广泛的“交流”。这里需要指出的是，如前所述，由于SUMO化修饰的靶蛋白通常是低丰度蛋白，而且SUMO化本身的相对丰度也很低，本文鉴定出的内源性SUMO化修饰的位点的数量无法与相同实验条件下内源性泛素化修饰位点的鉴定数量相提并论。但随着质谱设备的升级，在样品起始量充足，且进行足够样品分级的前提下，我们相信这种新颖的方法可以成为研究人员的一柄利器，开凿出SUMO化修饰这块研究尚浅的“和氏美玉”。

参考文献：

1、Hendriks, I. A., D'souza, R. C., Yang, B., Verlaan-de Vries, M., Mann, M., & Vertegaal, A. C. (2014). Uncovering global SUMOylation signaling networks in a site-specific manner.Nature structural & molecular biology, 21(10), 927-936.

2、Lumpkin, R. J., Gu, H., Zhu, Y., Leonard, M., Ahmad, A. S., Clauser, K. R., ... & Komives, E. A. (2017). Site-specific identification and quantitation of endogenous SUMO modifications under native conditions.Nature Communications, 8(1), 1171.

3、Meyer, J. G., Kim, S., Maltby, D. A., Ghassemian, M., Bandeira, N., & Komives, E. A. (2014). Expanding proteome coverage with orthogonal-specificity α-lytic proteases.Molecular & Cellular Proteomics, 13(3), 823-835.